基于網絡藥理學-分子對接技術研究貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的作用機制

程艷野，習彎彎，毛雪楊，魏天怡，胡海瑞，李志剛*

(1．河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2．河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南鄭州450008)

大腸癌(colorectal cancer，CRC)包括直腸癌和結腸癌，其2020年新發病例數位居世界第3位，死亡病例數居第2位[1]。治療方式主要有手術、放化療等，在其發病及治療過程中癌因性疲乏(cancer-related fatigue，CRF)是較為常見的癥狀之一[2]。癌因性疲乏是指某種痛苦的、持久的、主觀的、有身體、情感及意識方面的疲乏感，與近期活動量不符，與腫瘤患者相關，而且妨害日常生活[3]。根據其特點，可將其歸屬于中醫“虛勞”范疇，臨床研究表明中醫藥可以作為癌因性疲乏的補充甚至替代治療[4]。2020年中成藥治療癌因性疲乏臨床應用指南指出貞芪扶正顆粒可以有效改善大腸癌根治術后患者疲乏狀態，并得到專家共識[4]。貞芪扶正顆粒由黃芪、女貞子組成，具有提高人體免疫功能，適應于各種疾病引起的虛損，可配合手術、放射線、化療使用，但其治療大腸癌相關性疲乏中的作用機制尚不明確。因此，本研究擬通過網絡藥理學-分子對接方法探討貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 貞芪扶正顆粒靶點篩選

以“女貞子”“黃芪”為關鍵詞，依次檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)收集藥物活性成分，篩選出藥物口服生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18的有效活性成分及其作用的蛋白質靶點[5]，然后通過Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)規范蛋白質靶點信息。

1.2 大腸癌相關性疲乏的靶點篩選

以“Colorectal cancer-related fatigue”為關鍵詞，挖掘GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(http://www.omim.org)等數據庫中大腸癌相關性疲乏的潛在靶點，在GeneCards數據庫中，如果靶點過多則設定Score≥5的目標靶點為潛在靶點，結合其他數據庫補充相關靶點，合并后刪除重復值。

1.3 貞芪扶正顆粒-大腸癌相關性疲乏的PPI網絡構建及重要靶點篩選

為明晰芪貞扶正顆粒藥物相關靶點與大腸癌相關性疲乏靶點間的相互作用，使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)平臺將藥物潛在作用的靶點基因同疾病基因進行匹配并繪制韋恩圖，得到交集靶點，并上傳至String 11.0數據庫(https://string-db.org)構建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡模型，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小相互作用設定為≥0.4，得到PPI網絡。然后通過CytoScape 3.7.2中的MCODE插件對其進一步分析，獲得該網絡中關鍵模塊，刪選出結果中同時大于節點度值分布(node degree distribution)、介數中心性(betweenness centrality)、接近中心性(closeness centrality)三者中位數的靶點，為該PPI網絡中的核心靶點。

1.4 GO生物分析與KEGG通路富集分析

將交集靶點上傳至Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)里的基因列表中，選定物種“homo sapiens”，設置P＜0.01，進行GO功能分析和KEGG通路富集分析，依據靶點富集程度進行降序，篩選排名靠前的生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular components，CC)、分 子 功 能(molecular function，MF)和通路，并通過微生信平臺對其可視化。

1.5 貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關性疲乏靶點-通路網絡圖的構建

運用CytoScape 3.7.2構建貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關性疲乏靶點-通路網絡圖，將活性成分根據其度值排序，篩選出排名靠前的有效成分為關鍵成分，可供分子對接用。

1.6 分子對接驗證

從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載1.5篩選出的關鍵化合物的2D結構的sdf格式文件，通過OpenBabel轉換為mol2格式，導入AutoDockTools 1.5.6軟件中，檢查其空間結構無誤后，將其添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均改為默認可旋轉并保存為pdbqt格式，作為對接配體。選取前4位1.3篩選出的核心靶點，于Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)尋找活性成分的3D構想，將查詢的PDBID輸入PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中并下載其相應蛋白的3D結構的pdb格式。將此3D結構導入AutoDockTools 1.5.6軟件中，進行去除水分子、加氫、加電荷及各項優化，然后設置網格箱(gird box)為默認值并將其保存，最后將優化后的蛋白保存為pdbqt格式，作為對接受體。根據靶蛋白中配體的坐標以及靶蛋白活性口袋(gird box中數據)進行設置，采用AutoDock Vina1.1.2進行分子對接并得到結果，將結果導入PyMOL軟件中進行可視化。

2 結果

2.1 芪貞扶正顆粒活性成分靶點的獲取

初步提取女貞子化學成分119種、黃芪化學成分87種，經藥物口服生物利用度、藥物相似性值篩選后共獲得黃芪20個，女貞子13個活性成分，見表1。女貞子成分作用靶點321個、黃芪成分作用靶點349個，合并后刪除重復值共得到靶點209個。

表1 貞芪扶正顆粒主要成分

2.2 大腸癌相關性疲乏靶點的獲取

從GeneCards數據庫獲得大腸癌相關性疲乏靶點2 330個。根據經驗設定Score大于中位數的目標靶點為大腸癌相關性疲乏的潛在靶點，如通過GeneCards所得大腸癌相關疲乏靶點Score最大值為116.57，最小值為0.35，取Score≥5.0的靶點為大腸癌相關性疲乏的潛在靶點。結合OMIM、TTD、DRUGBANK數據庫補充相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到975個大腸癌相關性疲乏相關靶點。

2.3 貞芪扶正顆粒-大腸癌相關性疲乏PPI網絡的構建及核心靶點

將篩選的貞芪扶正顆粒活性成分靶點與大腸癌相關性疲乏疾病靶點取交集，繪制韋恩圖見圖1，得到貞芪扶正顆粒-大腸癌相關性疲乏共同靶點111個。進而將靶點提交至String 11.0平臺，得到一個111個節點，2 412條邊的PPI網絡，下載tsv格式，導入Cytoscope 3.7.2軟件中進行可視化，見圖2。經MCODE分析后得出4個模塊，排除Score小于10的模塊，得到1個模塊。通過NetworkAnalyzer工具對該網絡分析，篩選出節點度值、介數中心性、接近中心性均大于中值的靶點，得到29個核心靶點見表2。

圖1 貞芪扶正顆粒-大腸癌相關性疲乏韋恩圖

圖2 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏相關靶點蛋白互作圖

表2 核心靶點信息

2.4 GO生物分析與KEGG通路富集分析

將交集靶點導入Metascape平臺進行GO分析和KEGG通路分析，KEGG通路分析見圖3，主要有癌癥的通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、細胞衰老等通路，具體靶點通路富集結果見表3，說明貞芪扶正顆粒的活性成分靶點分布于多條通路，各通路協調治療大腸癌相關性疲乏。

表3 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏靶點通路富集結果

圖3 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的KEGG富集分析

GO分析結果見圖4，生物過程主要涉及到對無機物質的反應、對外源刺激的反應、細胞遷移的正調控等方面；細胞組分主要涉及到膜筏、膜微域、轉錄調節復合物等位置；分子功能主要涉及到蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、激酶活性等過程。

圖4 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的GO富集分析

2.5 貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關性疲乏靶點-通路網絡圖的構建

應用CytoScape 3.7.2構建貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關性疲乏靶點-通路網絡見圖5。網絡中節點度值較高的前5個藥物成分槲皮素(節點度值100)、木犀草素(節點度值46)、山柰酚(節點度值32)、β-谷甾醇(節點度值14)、毛蕊異黃酮(節點度值14)，可能為發揮治療作用的關鍵成分，對其進行分子對接。

圖5 貞芪扶正顆粒有效成分-靶點-通路網絡

2.6 分子對接結果

選取核心靶點AKT1、JUN、MMP9、VEGFA與貞芪扶正顆粒中槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮活性成分進行分子對接。結合能＜0表示化合物與蛋白有結合能力，結合能＜-5.0 kcal/mol表示化合物與蛋白結合良好，結合能＜-7.0 kcal/mol表示化合物與蛋白結合能力極好[6]。分子對接結果見表4，顯示JUN與山柰酚、JUN與毛蕊異黃酮、JUN與木犀草素、MMP9與木犀草素之間有較強的結合力。利用PyMOL將配體中結合能最強的成分與靶點繪制成分與靶點對接模式圖見圖6，山柰酚與靶點JUN的ARG-155、DC-5009形成氫鍵，毛蕊異黃酮與靶點JUN的PRO-418形成氫鍵，木犀草素與靶點JUN的GLU-568、GLN-671形成氫鍵，與靶點MMP9的TYR-420形成氫鍵。

圖6 成分-靶點對接相互作用模式

表4 貞芪扶正顆粒關鍵活性成分與核心靶點的分子對接結果

3 討論

2020年癌因性疲乏歐洲腫瘤內科學會(European Society of Oncology Medicine，ESMO)指南指出，有65%的腫瘤患者伴隨CRF，在放療或化療期間疲乏發生率為80%～90%，嚴重影響患者的生存質量[7]。其病因及發病機制尚不明確，病因可能與腫瘤本身、腫瘤相關治療、并發癥、社會心理因素等相關，機制可能與細胞因子失調、下丘腦調節回路損壞、5-羥色胺(5-HT)失調、線粒體和肌肉失調、基因多態性等有關[8]。研究表明大腸癌患者在進行手術、化療治療后，普遍存在CRF[9-10]。貞芪扶正顆粒組方中黃芪為補藥之長，補氣固表；女貞子扶正固本、滋補肝腎，兩藥合用加強益氣健脾、滋陰補腎效果。現代藥理學研究黃芪主要有多糖類、皂苷類、黃酮類等化學成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等藥理作用[11]；女貞子含三萜類、環烯醚萜類、苯乙醇苷類及黃酮類等化學成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮痛等活性[12]。張殿寶等[13]通過觀察120例大腸癌術后CRF患者，發現貞芪扶正顆粒可明顯降低疲乏量表評分，提高機體免疫功能，改善疲乏癥狀。本次研究通過網絡藥理學研究發現貞芪扶正顆粒作用機制可能有以下幾方面。

3.1 促進腫瘤細胞的凋亡

CRF可直接由惡性腫瘤產生并成為其直接癥狀[14]，本次研究中核心成分槲皮素可以使結腸癌大鼠caspase-3在內的凋亡基因表達增加，Bcl-2等抗凋亡基因表達減少，促進結腸癌細胞的凋亡[15]。木犀草素阻斷人體大腸癌HCT116細胞的細胞轉化，還可刺激奧沙利鉑處理的大腸癌細胞的增殖[16]。山奈酚促進了大腸癌HCT116和HCT15細胞中PARP的裂解和半胱氨酸蛋白酶caspase-8、-9、-3、磷酸化p38MAPK、p53、p21的激活[17]。毛蕊異黃酮可通過ERβ介導的EGFR-P13K-Akt/EGFR-MAPKs通路抑制結腸癌HCT116和HT29細胞的增殖并誘導其凋亡[18]。核心靶點AKT1激酶在腫瘤從生長演變為惡性轉移的過程中發揮重要作用[19]。JUN與CRC細胞中的USP28啟動子結合，USP28可以穩定ZNF304蛋白，該蛋白在KRAS突變的CRC患者中標記一些抑制腫瘤生長的基因，使其關閉[20]。KEGG分析顯示貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的通路以癌癥的通路為主，有60個靶點作用于該通路。在一項觀察貞芪扶正顆粒對結直腸癌腫瘤生長的研究中，發現貞芪扶正顆粒可以減小結直腸癌模型小鼠腸內腫瘤的尺寸及數量[21]。

3.2 改善線粒體和肌肉功能

患有慢性應激的癌癥患者在體內會不斷產生氧化應激反應，從而在組織細胞中產生大量活性氧[22]，使線粒體呼吸和能量供應減少，損害人體正常的有氧代謝和肌肉耐力，導致CRF的產生。核心成分槲皮素可以直接清除活性氧，也可以間接誘導超氧化物歧化酶產生谷胱甘肽，作為氫供體與結合，轉化為H2O2；同時調節非酶依賴性抗氧化防御系統途徑，導致活性氧水平降低[23]。木犀草素可以激活Nrf2/ARE信號通路降低活性氧[24]。研究表明貞芪扶正顆粒能夠提高超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物GSH-Px水平，降低活性氧含量[25]。

3.3 調節細胞因子

腫瘤細胞釋放的炎癥細胞因子，在影響正常細胞代謝的同時，也刺激癌細胞生長，造成了機體機能下降，產生疲乏[14]。結直腸癌引發的遺傳損傷，使屏障惡化導致微生物產物侵入腺瘤，產生腫瘤引發的炎癥[26]。炎癥因子可激活誘導下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸，釋放皮質類固醇激素增多促進機體的炎癥反應，導致疲乏的產生[27]。某些炎性因子如IL-6、TNF-α與5-HT構成反饋環路，5-HT可抑制炎性因子合成，當炎性因子合成增加時，會使5-HT的釋放增加，癌癥病人長期處于病理狀態，機體反饋環路已經紊亂，炎性因子的合成不受抑制，刺激5-HT的釋放，產生疲乏，同時5-HT水平會破壞HPA軸[28-29]。貞芪扶正核心成分槲皮素具有抗炎能力，可抑制CRC患者促腫瘤壞死因子TNF-α的釋放[30]。β-谷甾醇使細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成減少，機制是抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NLRP3的激活，從而抑制CAS1產生及MAPK信號通路活化[31]。說明貞芪扶正顆粒可以通過直接抗炎、間接調控HPA軸，降低5-HT水平，改善疲乏狀態。核心靶點MMP9由于其蛋白水解活性，通過調節癌細胞的遷移、上皮-間質轉化和存活、誘導免疫應答、血管生成和腫瘤微環境的形成，在腫瘤發生中發揮關鍵作用[32]。VEGFA的減少可能與慢性疲勞綜合征有關[33]。本次研究中細胞炎性因子、表皮生長因子受體EGFR均可刺激PI3K，進而催化細胞膜上3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)的產生，激活PI3K-AKT信號通路[34]。這與人參皂苷可以緩解老年大鼠疲勞綜合征，其機制與激活PI3K-AKT信號通路有關的研究相符合[35]。

本研究證實貞芪扶正顆粒中槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮核心成分作用于AKT1、JUN、MMP9、VEGFA靶點激活癌癥的通路、PI3K-AKT信號通路來治療大腸癌相關性疲乏。證明了貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的多成分、多靶點、多通路的特點，為貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關性疲乏的機制研究及臨床應用提供了依據。