復方皂刺湯對順鉑聯合吉西他濱抑制非小細胞肺癌生長的作用及其機制研究

齊建考，湯 肖，孫世輝，寇艷方，崔志勤*

(寧晉縣中西醫結合醫院，河北 邢臺055550)

肺癌是癌癥相關死亡的第一大原因，在肺癌病例中，非 小 細 胞 肺 癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占總發病率的80%～85%[1]。NSCLC的體征和癥狀通常出現在晚期，表現為無法治愈的局部病灶或轉移性疾病，盡管NSCLC的治療取得了較大的進展，但NSCLC仍無法根治，總體5年存活率為14%[2]。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤新藥勢在必行。中醫藥在預防和治療疾病方面有著悠久的歷史，包括肺癌[3-4]。復方皂刺湯是在肺積方的基礎上化裁增減并結合中西醫藥理論擬成的方藥，本方由皂角刺、雞血藤、當歸、山茱萸等組成，方中選擇用平和而補氣益陰之上品，結合能攻癌而無毒之皂角刺，已被證明對肺癌療效顯著[5]。然而其抗NSCLC的作用機制尚未清晰。血管生成是腫瘤生長和轉移擴散的關鍵組成部分，血管生成的介質血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在許多惡性腫瘤中高表達，包括NSCLC，腫瘤或血清中VEGF的表達與不良的生存結果和治療反應有關[6]。在晚期不可治愈的NSCLC患者中，以順鉑為基礎的聯合治療可提高存活率，此外，順鉑聯合抗癌藥物，如吉西他濱、紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱或培美曲塞，被推薦為大多數患者的一線治療選擇[7]。此外，中醫結合化療可改善患者生活質量、延長生存時間、增加化療的敏感性和減輕化療的副作用[8]。然而，關于復方皂刺湯聯合化療對NSCLC血管生成的作用尚不清晰，因此，本研究旨在闡明復方皂刺湯方劑在順鉑聯合吉西他濱基礎上治療NSCLC的分子作用機制，為復方皂刺湯聯合化療在NSCLC治療中的作用提供科學證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及實驗動物人非小細胞肺癌A549細胞株購自Procell Life Science &Technology Co.,Ltd.(中國武漢)。4周齡SPF級BALB/c裸鼠50只，體質量14～16 g，購自河北醫科大學生物醫學工程中心，生產許可證號SCXK(冀)2019-001，飼養于河北醫科大學實驗動物公共服務平臺，使用許可證號SYXK(冀)020-002，適應性飼養一周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑及儀器皂角刺、雞血藤、川芎、威靈仙、當歸、紅花、山茱萸由江蘇省中醫院發配以及代為煎煮；順鉑購自齊魯制藥有限公司；吉西他濱購自浙江海正藥業股份有限公司；DMEM培養基購自Gibco公 司(上 海)；TUNEL凋 亡 試 劑 盒 購 自 武 漢Elabscience；一 抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、Ki67、CD31、α-SMA和VEGF購自Cell Signaling Technology，Inc.(上海)；二抗購自英國Abcam公司；白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試 劑 盒 購 自ZCIBIO Technology Co.,Ltd.(上海)；BA210Digital數碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實業集團；JY200C電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將A549細胞置于DMEM培養液中(含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素)在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，待細胞生長至匯合度為70%～80%時，0.25%胰酶消化后按1∶2進行傳代。

1.2.2 復方皂刺湯的制備復方皂刺湯由皂角刺50 g，雞血藤30 g，川芎15 g，威靈仙12 g，當歸、紅花、山茱萸各10 g組成，取中藥飲片置于電動煎藥壺內，加入1 000 mL的蒸餾水浸泡1 h，大火煮沸30 min，紗布過濾，藥渣再加入800 mL蒸餾水繼續煎煮20 min，過濾。合并兩次濾液，經旋轉蒸發儀真空減壓濃縮，濃縮至約生藥含量7.6 g/mL的溶液，分裝，-80℃凍存備用。

1.2.3 裸鼠A549移植瘤模型制備及分組給藥取對數生長期的A549細胞，采用PBS緩沖液重懸細胞(濃度為1×107/mL)，裸鼠固定并酒精消毒后，在裸鼠右前肢腋窩靠背部0.3～0.5 cm處接種A549細胞懸液200 μL，常規飼養并觀察裸鼠狀態，當裸鼠瘤體直徑＞5 mm時，將裸鼠隨機分為5組(n=10)：模型組每天灌胃生理鹽水(0.01 mL/g)；復方皂刺湯組每天灌胃復方皂刺湯(1 mL/只)；吉西他濱聯合鉑類(GP)方案化療組每3天腹腔注射1次順鉑(2 mg/kg)和吉西他濱(50 mg/kg)；順鉑組每3天腹腔注射1次順鉑(2 mg/kg)；復方皂刺湯聯合GP方案化療組每天灌胃復方皂刺湯(1 mL/只)，并且每3天腹腔注射1次順鉑(2 mg/kg)和吉西他濱(50 mg/kg)。各組共給藥治療21 d，分別于給藥第3、7、14、21天用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積：V=(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)/2。給藥結束后，采用戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉裸鼠，腹主動脈采集血樣，完整剝離腫瘤組織，測量瘤質量，計算抑瘤率，抑瘤率=(1-用藥組平均瘤質量/模型組平均瘤質量)×100%。隨后取部分腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定，部分放入-80℃保存，用于后續檢測。

1.2.4 TUNEL染色觀察腫瘤細胞凋亡取4%多聚甲醛固定的腫瘤組織，石蠟包埋，制作厚5 μm的切片，胃蛋白酶消化30 min，滴加50 μL的TUNEL反應混合物孵育1 h，滴加DAPI顯色10 min，PBS清洗3次，甘油封片，熒光顯微鏡觀察并分析。

1.2.5 免疫組織化學法檢測腫瘤組織Ki67、CD31、α-SMA和VEGF表達取4%多聚甲醛固定的腫瘤組織，石蠟包埋，制作厚5 μm的切片，3%甲醇雙氧水室 溫10 min，分 別 與Ki67(1∶100稀 釋)、CD31(1∶100稀釋)、α-SMA(1：100稀釋)和VEGF(1∶200稀釋)一抗在4℃孵育過夜，應用二氨基聯苯胺(DAB)和蘇木精染色，中性樹膠封片，采用BA210Digital數碼三目攝像顯微鏡對切片進行圖像采集，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定圖像的光密度，確定Ki67、CD31、α-SMA、VEGF陽性染色的強度。

1.2.6 ELISA檢測血清IL-4、IL-6和TNF-α濃度血液樣品3 500 r/min離心15 min，收集上清液，采用試劑盒分別檢測裸鼠血清IL-4、IL-6、TNF-α濃度，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明操作。

1.2.7 Western blot法檢測腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達取-80℃下保存的腫瘤組織，使用RIPA裂解緩沖液從腫瘤組織樣本中提取總蛋白，BCA法進行蛋白質定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，后轉移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。轉移后用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，然后在4℃下分別與一抗(Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin)孵育過夜，一抗的稀釋比均為1∶1 000。接著，將膜用含有0.1% Tween-20的Tris緩沖鹽水(TBST)浸泡，并與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育1 h，免疫反應條帶由ECL試劑盒和成像系統確定，以β-actin為內參，采用ImageJ軟件進行定量分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計處理，試驗數據均以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析統計，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 復方皂刺湯聯合化療對非小細胞肺癌裸鼠移植瘤體積和質量的影響

裸鼠接種A549細胞懸液，7～10 d可見瘤體出現，成瘤率100%，裸鼠在接種后精神、活動、飲食等行為未出現明顯不適，模型構建成功圖及瘤體圖如圖1所示。給藥第3和7天時各組裸鼠移植瘤體積差異無統計學意義(P＞0.05)；給藥第14和21天時，與模型組比較，其他4組裸鼠腫瘤體積均明顯減小(P＜0.05)，與復方皂刺湯組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組裸鼠腫瘤體積明顯減小(P＜0.05)；給藥第21天時，與GP方案化療組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組裸鼠腫瘤體積明顯減小(P＜0.05)；給藥第21天時，與順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組裸鼠腫瘤體積明顯減小(P＜0.05)(表1)。給藥第21天，與模型組比較，其他4組裸鼠瘤質量明顯降低，抑瘤率明顯升高(P＜0.05)，與復方皂刺湯組、GP方案化療組、順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組裸鼠瘤質量明顯降低，抑瘤率明顯升高(P＜0.05)，見表2。與模型組比較，*P＜0.05；與復方皂刺湯組比較，#P＜0.05；與GP方案化療組比較，ΔP＜0.05；與順鉑組比較，▲P＜0.05.

表1 各組裸鼠移植瘤體積的變化(mm3，n=10)

表2 各組裸鼠移植瘤第21天瘤質量及抑瘤率(n=10)

圖1 模型構建成功圖及不同組處理后腫瘤圖

2.2 復方皂刺湯聯合化療對非小細胞肺癌裸鼠移植瘤生長能力的影響

TUNEL染色結果如圖2A和C所示，與模型組比較，其他4組細胞凋亡率均明顯升高(P＜0.05)；與復方皂刺湯組比較，GP方案化療組、順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)；與GP方案化療組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)；與順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組細胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。免疫組化結果顯示如圖2B和D所示，與模型組比較，GP方案化療組、順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組Ki67表達明顯降低(P＜0.05)；與復方皂刺湯組比較，GP方案化療組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組Ki67表達明顯降低(P＜0.05)；與GP方案化療組、順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組Ki67表達明顯降低(P＜0.05)。

圖2 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡情況

Western blot分析結果如圖3所示，與模型組比較，GP方案化療組、順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組Bax、Caspase-3蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P＜0.05)；與GP方案化療組、順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組Bax、Caspase-3蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。

圖3 各組裸鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況

2.3 復方皂刺湯聯合化療對非小細胞肺癌裸鼠血清炎癥因子的影響

ELISA檢測結果如表3所示，與模型組比較，其他4組小鼠血清IL-6、TNF-α濃度明顯降低，IL-4濃度明顯升高(P＜0.05)；與復方皂刺湯組比較，GP方案化療組、順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組IL-6、TNF-α濃度明顯降低，順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組IL-4濃度明顯升高(P＜0.05)；與GP方案化療組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組IL-6、TNF-α濃度明顯降低，IL-4濃度明顯升高(P＜0.05)；與順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組IL-6濃度明顯降低(P＜0.05)，IL-4、TNF-α濃度差異無明顯統計學含量(P＞0.05)。

表3 各組裸鼠血清IL-4、IL-6、TNF-α濃度(n=10)

2.4 復方皂刺湯聯合化療對非小細胞肺癌裸鼠移植瘤血管生成相關細胞因子的影響

免疫組化結果如圖4所示，與模型組比較，其他4組CD31、VEGF蛋白表達明顯降低，GP方案化療組、順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組α-SMA蛋白表達明顯降低(P＜0.05)；與復方皂刺湯組比較，順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組CD31蛋白表達降低，GP方案化療組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組α-SMA蛋白表達明顯降低，GP方案化療組、順鉑組、復方皂刺湯聯合GP方案化療組VEGF蛋白表達明顯降低(P＜0.05)；與GP方案化療組、順鉑組比較，復方皂刺湯聯合GP方案化療組CD31、α-SMA、VEGF蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織CD31、α-SMA、VEGF蛋白相對表達水平

3 討論

當前NSCLC化療方案引發的不良臨床反應推動著研究者尋找新的治療策略，開發有效的、副作用少的中藥聯合化療將有助于改善肺癌患者的臨床結局[9]。復方皂刺湯已顯示出體內對NSCLC的抗腫瘤活性[10]。然而，關于復方皂刺湯對提高GP方案化療抑制NSCLC生長的機制尚未見報道。因此，本研究評估了復方皂刺湯在GP方案化療基礎上抗NSCLC的機制，以期為抗NSCLC治療提供基礎依據。

誘導細胞凋亡是抗癌藥物的關鍵機制[11]，為了研究復方皂刺湯對提高GP方案化療的細胞毒性，本研究分析了腫瘤組織細胞的凋亡。與單一藥物比較，在復方皂刺湯聯合GP方案化療中，TUNEL陽性染色和染色質凝集明顯。與我們的結果相似，中藥制劑華蟾素聯合吉西他濱治療NSCLC可以進一步降低HCC827細胞活力，提高細胞生存抑制率[12]。此外，評估復方皂刺湯聯合GP方案化療對裸鼠A549細胞移植瘤的抗腫瘤效果，結果表明復方皂刺湯聯合GP方案化療組裸鼠的平均腫瘤體積和瘤質量明顯低于模型組、復方皂刺湯組、順鉑組、GP方案化療。這表明復方皂刺湯聯合GP方案化療具有良好的毒性，復方皂刺湯聯合GP方案化療比GP方案化療療法更具優勢。多項研究提供的證據表明，與單一藥物治療比較，吉西他濱與其他藥物如雙氫青蒿素[13]、紫杉醇[14]、拓撲替康[15]聯合使用可以增強對腫瘤生長的抑制，我們的結果與其報道具有相似性。以往研究表明，GP方案化療可誘導多種促凋亡反應，從而誘導多種腫瘤的細胞凋亡[16]。P53蛋白的激活在腫瘤細胞對藥物的反應中起著至關重要的作用，而Bax是其下游的效應蛋白[17]，在復方皂刺湯聯合GP方案化療作用下，Bax蛋白被激活，提示復方皂刺湯聯合GP方案化療可能導致NSCLC發生細胞凋亡。Caspase-3是由不同刺激引發的細胞凋亡關鍵的蛋白水解酶介體，Bcl-2則為細胞存活率蛋白[18]。復方皂刺湯聯合GP方案化療處理激活了Caspase-3蛋白，抑制Bcl-2蛋白表達，與我們的結果一致的是，大黃素和吉西他濱聯合治療導致胰腺癌耐藥細胞株Bxpc-3/Gem細胞增殖減少，細胞凋亡增加[19]。表明復方皂刺湯聯合GP方案化療可能通過下調抗凋亡基因Bcl-2和上調促凋亡基因Bax來實現促NSCLC發生細胞凋亡。

基于體外抗血管生成和細胞凋亡活性，本研究評估了復方皂刺湯聯合GP方案化療對NSCLC血管生成的影響。VEGF在體內和體外均是一種有效的血管生成誘導劑，VEGF在多種人類腫瘤中表達上調，包括肺癌，而實體腫瘤的發展似乎需要VEGF刺激的血管生成[6]。抑制VEGF的表達反過來又能抑制體內的腫瘤血管生成和縮小裸鼠的腫瘤體積，VEGF也經常在血管生成抑制劑的臨床試驗中被評估，并被接受為藥物活性的標志[20]。CD31是跨膜糖蛋白，在血管內皮細胞的連接處高表達，是內皮細胞標志物，CD31是特異性的新生血管標記物[21]。α-SMA陽性表達于血管周圍，在淀粉樣血管病變中發現α-SMA表達減少，可能會影響血管的功能[22]。在本研究中，我們發現復方皂刺湯聯合GP方案化療抑制了NSCLC裸鼠腫瘤組織CD31、α-SMA、VEGF的產生。這表明復方皂刺湯聯合GP方案化療抑制血管生成可能是減少毒性化療的機制之一。Hou等[23]研究顯示在EPIC1敲除的荷瘤小鼠中，腫瘤組織中CD31的表達減少，抑制了血管生成，我們的結果與其相似。此外，TNF-α是廣泛分布于內皮細胞表面的細胞因子，與內皮細胞的增殖、血管新生密切相關。IL-6在腫瘤患者中呈現高表達狀態，可作為診斷標志物，而IL-4、VEGF可參與機體免疫耐受，在腫瘤復發中發揮重要作用[24-25]。本研究結果顯示復方皂刺湯聯合GP方案化療抑制了NSCLC裸鼠血清中IL-6、TNF-α含量，促進了IL-4含量升高。這表明復方皂刺湯聯合GP方案化療抑制了血清促炎癥因子的釋放。

綜上所述，本研究結果表明復方皂刺湯聯合GP方案化療在抑制NSCLC裸鼠移植瘤模型中的腫瘤生長方面具有積極效果。復方皂刺湯聯合GP方案化療抑制血管生成、誘導細胞凋亡，復方皂刺湯增強了GP方案化療的抗腫瘤活性。復方皂刺湯聯合化療的使用可能是NSCLC治療的一種有前途的治療策略。