LncRNA FTH1P3通過調控PI3K/AKT信號通路促進胃癌細胞增殖和遷移能力*

周永興，譚觀橋，周大為，楊 釗

1.湖南省郴州市第四人民醫院普外科,湖南郴州 423000;2.湖南省郴州市第一人民醫院胃腸外科，湖南郴州 423000

胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤和第三大腫瘤相關死亡原因，其中死亡率最高的地區是東亞，包括中國[1]。盡管采用了包括手術、放療、化療和生物治療在內的綜合療法，但由于轉移引起的癌癥復發，胃癌患者5年生存率仍然很差[2]。同時目前仍然缺乏對胃癌進展機制的了解，因此，闡明參與胃癌增殖和遷移進展的分子機制對發現更有效的生物標志物和治療靶點，以改善患者生存和預后是必要的。多種長鏈非編碼RNA(LncRNA)失調并在許多惡性腫瘤中發揮致癌基因或抑癌基因的作用[3]，長鏈非編碼RNA鐵蛋白重鏈1偽基因3(LncRNA FTH1P3)是新近發現的LncRNA之一，位于染色體 2p23.3上，長度為 954 個核苷酸。有研究報道，LncRNA FTH1P3在宮頸癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等常見惡性腫瘤中高表達，均為促癌分子，促進腫瘤細胞的增殖、轉移和化療耐藥等腫瘤不良生物學行為[4-6]，并調控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、SP1/NF-κB等信號通路發揮抗腫瘤進展的作用[7-8]。然而，LncRNA FTH1P3在胃癌中的作用尚未闡明。本研究旨在驗證LncRNA FTH1P3在胃癌組織中的表達，評估其在胃癌進展中的臨床意義，并在細胞水平研究其在胃癌中的生物學功能和發揮作用的機制。

1 材料與方法

1.1標本來源 2014年1月至2015年10月，前瞻性地納入本院96例確診為胃癌的患者。納入標準：(1)術前評估原發性胃癌可切除，未懷疑遠處轉移；(2)行根治性胃切除術并充分清掃淋巴結；(3)術后病理明確為胃癌。排除標準：(1)同時患有另一種惡性腫瘤；(2)伴有嚴重心肺功能障礙、肺結核、克羅恩病或精神病等基礎疾病；(3)有除幽門螺桿菌感染外未控制的感染。手術室分離的胃癌組織和距離腫瘤3 cm的正常胃組織，立即用液氮冷凍并儲存在-80 °C環境中。同時本課題按照美國國立綜合癌癥網絡胃癌指南進行研究，獲得本院倫理審查委員會批準，并根據赫爾辛基宣言獲得所有受試者書面知情同意。

1.2試劑和儀器 TRIzol 試劑、LncRNA FTH1P3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物、Lipofectamine 2000 試劑，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，美國Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix PCR試劑盒，美國Applied Biosystems公司；胃癌細胞株 MGC-803，中國上海醫學科學院細胞庫；RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素，Thermo Fisher Scientific公司；LncRNA FTH1P3 siRNA和陰性對照 siRNA，中國上海Obio Technology公司；CCK8試劑購自南京BestBio公司；Transwell小室，美國Corning公司；4周齡、28 g左右的BALB/c-nu雌性裸鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司；細胞裂解緩沖液、增強型 BCA 蛋白檢測試劑盒和增強型 ECLTM檢測試劑盒，中國南京KeyGene公司；BCA蛋白質測定試劑盒，美國Thermo試劑公司；PVDF膜，美國BioRad公司；PI3K、AKT、磷酸化PI3K(pPI3K)、磷酸化AKT(pAKT)、GAPDH和二抗，英國Abcam公司。

1.3qRT-PCR TRIzol試劑提取胃癌患者腫瘤和鄰近的正常組織總的RNA，并根據說明采用逆轉錄試劑盒進行RNA至cDNA的合成。以cDNA為模板使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒配制PCR反應體系，采用Applied Biosystems 7900HT 序列檢測系統測量LncRNA FTH1P3和內參GAPDH的表達。使用2-ΔΔCt方法評估LncRNA FTH1P3相對蛋白表達。引物序列：LncRNA FTH1P3 正向引物：5′-CTACGCCTCCTCCATTTA-3′，反向引物：5′-GCCACCTCGTTGGTTCTA-3′;GAPDH 正向引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′，反向引物：5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGT-3′。

1.4細胞培養和轉染 胃癌細胞MGC-803在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的RPMI-1640 培養基中培養，放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中。及時更換細胞培養基并在細胞長滿時采用胰酶消化并傳代。2×105個MGC-803細胞在6孔板中培養，隨機分為對照組si-NC組和實驗組si-LncRNA FTH1P3-1組、si-LncRNA FTH1P3-2組。細胞貼壁后，按照說明書使用Lipofectamine 2000 試劑用4 μg siRNA 進行轉染，即5 μL Lipofectamine 2000與4 μg 陰性對照siRNA 轉染si-NC組、5 μL Lipofectamine 2000與4 μg LncRNA FTH1P3 siRNA-1轉染si-LncRNA FTH1P3-1組、5 μL Lipofectamine 2000與4 μg LncRNA FTH1P3 siRNA-2轉染si-LncRNA FTH1P3-2組。放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中轉染48 h，通過qRT-PCR檢測LncRNA FTH1P3 siRNA的干擾效果。

1.5CCK8實驗 采用96孔板和CCK8試劑進行細胞增殖能力的測定。收集各組細胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗1次后，將2×103個各組MGC-803細胞懸浮在150 μL含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基中，并加至96孔板中，每組設置6個平行復孔，放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中培養。將細胞貼壁計為第0 h，以及每隔24 h計為24 h、48 h和72 h。分別在對應的時間點更換100 μL 培養基，并加入10 μL CCK8試劑混勻并繼續培養2 h后，采用酶標儀檢測各細胞在450 nm處測定吸光度值。

1.6Transwell實驗 采用24孔板和8 μm孔徑的Transwell小室進行細胞遷移能力的測定。收集各組細胞，無血清培養基洗3次后，將1×105個各組MGC-803細胞懸浮在100 μL 的無血清RPMI-1640培養基中，并加至上室中培養。將含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(500 μL)添加到24孔板的下室中，每組設置3個平行復孔，放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤培養箱中培養12 h。用棉簽去除殘留在Transwell小室上側的細胞。將遷移到Transwell小室下側的細胞固定在甲醇中，在室溫下用結晶紫染色30 min，在顯微鏡下拍照計數。

1.7裸鼠體內實驗 采用BALB/c-nu裸鼠體內實驗檢測細胞體內成瘤能力。裸鼠隨機分為si-NC組和實驗組si-LncRNA FTH1P3-1組、si-LncRNA FTH1P3-2組，每組6只。收集各組細胞，PBS洗3次后，將2×106個各組MGC-803細胞懸浮在100 μL的PBS中，接種至裸鼠右腋窩皮下。每周采用游標卡尺測量一次皮下腫瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，按體積 =(a×b)/2的公式計算腫瘤體積。培養4周左右處死裸鼠，將瘤體解剖并稱重。

1.8Western blot實驗 采用細胞裂解緩沖液從各組細胞中提取細胞總蛋白，并使用增強型 BCA蛋白檢測試劑盒定量蛋白質水平。蛋白質煮沸變性后，通過8%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并電轉移到PVDF上，并將帶有沉積蛋白的PVDF膜在Tris緩沖鹽水Tween(TBST)中封閉1 h。用待檢測一抗與PVDF膜孵育，在4 ℃下過夜，TBST洗3次后，與二抗常溫孵育1 h。通過增強型ECLTM檢測試劑盒可視化蛋白質條帶。

2 結 果

2.1LncRNA FTH1P3在胃癌組織中表達上調 qRT-PCR檢測LncRNA FTH1P3在胃癌組織中的表達(1.51±0.74)顯著高于在鄰近的正常組織中的表達(0.94±0.55)，差異有統計學意義(t=5.128,P<0.05)。見圖1。

注：胃癌組織與鄰近的正常組織相比，*P<0.05。

2.2LncRNA FTH1P3表達與胃癌患者病理參數的關系 高表達LncRNA FTH1P3與胃癌患者年齡、性別無關(P>0.05)，與患者腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結轉移情況和TNM分期有關(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA FTH1P3蛋白在胃癌組織中的表達與臨床病理參數之間的關系

2.3LncRNA FTH1P3表達與胃癌患者預后的關系 Log-rank檢驗顯示，與低表達LncRNA FTH1P3的胃癌患者相比，高表達LncRNA FTH1P3的胃癌患者預后較差(χ2=4.811，P=0.028)，見圖2。

圖2 Log-Rank檢驗分析LncRNA FTH1P3表達與胃癌患者預后的關系

2.4LncRNA FTH1P3 siRNA轉染胃癌細胞效果 LncRNA FTH1P3在si-LncRNA FTH1P3-1組(0.40±0.07)、si-LncRNA FTH1P3-2組(0.47±0.08)MGC-803細胞中的表達均低于在si-NC組MGC-803細胞中的表達(1.00±0.06)，差異有統計學意義(t=12.081，P<0.05；t=9.731，P<0.05)，見圖3。

注：與si-NC組相比，*P<0.05。

2.5細胞增殖能力檢測 與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細胞MGC-803的增殖能力均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：與si-NC組相比，*P<0.05。

2.6細胞遷移能力檢測 與si-NC組[遷移細胞數目(52.33±7.53)個]相比，si-LncRNA FTH1P3-1組[遷移細胞數目(19.67±4.28)個]和si-LncRNA FTH1P3-2組[遷移細胞數目(33.67±5.81)個]胃癌細胞MGC-803的遷移能力均降低，差異有統計學意義(t=6.531，P<0.05；t=3.398，P<0.05)，見圖5。

2.7細胞體內成瘤能力檢測 與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細胞MGC-803的體內成瘤體積均減小(P<0.05)，見圖6A。與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細胞MGC-803的體內成瘤體質量均減少(P<0.05)，見圖6B。

注：A為3組成瘤體積的對比；B為3組成瘤體質量的對比；與si-NC組相比，*P<0.05。

2.8PI3K/AKT信號通路檢測 與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細胞MGC-803中PI3K/AKT信號通路蛋白pPI3K和pAKT的表達減少(P<0.05)，PI3K和AKT蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖7 PI3K/AKT信號通路檢測

3 討 論

LncRNA 被定義為大于200個核苷酸且不能被翻譯成蛋白質的RNA轉錄本，其作為參與正常發育和腫瘤發生的重要分子而受到廣泛關注。越來越多的研究表明，LncRNA在細胞增殖、分化、遷移、細胞周期和凋亡等多種生物學過程中發揮著重要的調控作用[3]。胃癌中異常表達的LncRNA有希望成為腫瘤生物標志物和抗腫瘤治療的分子靶點[9]。目前盡管已經發現了大量 LncRNA，但 LncRNA 在胃癌進展中的潛在功能仍需要進一步研究。FTH1P3 屬于LncRNA，是鐵蛋白重鏈(FHC)基因家族的成員之一。LncRNA FTH1P3在不同的人類細胞系和組織中廣泛表達，并在細胞分化過程中發揮正向調節作用[10]。LncRNA FTH1P3在腫瘤中的作用也逐漸被重視，具有成為腫瘤治療潛在分子靶點的潛力[4-8]。

YUAN等[11]報道LncRNA FTH1P3在喉鱗狀細胞癌組織中的表達比在非腫瘤組織中的表達增加，并且LncRNA FTH1P3高表達與患者分化差、T分期高、淋巴結轉移陽性、臨床分期高呈正相關，高表達的LncRNA FTH1P3 預示著喉鱗狀細胞癌患者預后不良。LncRNA微陣列分析顯示LncRNA FTH1P3在吉非替尼耐藥非小細胞肺癌細胞中表達上調，LncRNA FTH1P3高表達與非小細胞肺癌患者的不良預后密切相關[6]。在口腔鱗狀細胞癌組織中高表達的LncRNA FTH1P3與腫瘤T分期、N分期、TNM分期和不良預后有關，Cox回歸分析顯示LncRNA FTH1P3表達是口腔鱗狀細胞癌患者的獨立預后預測因素[7]。而LncRNA FTH1P3在胃癌中的表達情況未知，本研究發現與鄰近正常組織相比，LncRNA FTH1P3在胃癌組織中的表達上調，統計分析顯示LncRNA FTH1P3的表達與胃癌患者腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結轉移情況和TNM分期有關，高表達LncRNA FTH1P3的胃癌患者預后較差，具有重要的臨床意義，與LncRNA FTH1P3在喉鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌和口腔鱗狀細胞癌中的研究一致[6-7,11]。表明LncRNA FTH1P3是胃癌患者預后不良的生物分子標志物，可能是促進胃癌惡性進展的驅動分子。

同時LYU等[4]報道LncRNA FTH1P3在宮頸癌組織和細胞系中表達顯著上調，干擾LncRNA FTH1P3的表達會抑制細胞增殖、侵襲和遷移，促進宮頸癌細胞凋亡，作用機制是通過靶向微小RNA(miR)-145發揮促癌因子的作用。以及LncRNA FTH1P3表達升高會促進喉鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡[11]。LncRNA FTH1P3在體外促進非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲，LncRNA FTH1P3的敲低抑制體內腫瘤的生長[6]。本研究結果提示LncRNA FTH1P3與胃癌的生長和轉移相關，本研究中采用LncRNA FTH1P3 siRNA的兩個干擾序列轉染胃癌細胞研究LncRNA FTH1P3的生物學功能，結果兩個干擾序列均顯示，抑制LncRNA FTH1P3的表達后，胃癌細胞體外增殖和遷移能力降低，體內成瘤能力降低，表明LncRNA FTH1P3促進胃癌的惡性進展。

但是LncRNA FTH1P3在胃癌中發揮促癌作用的機制仍需進一步探討，有文獻報道，在非小細胞肺癌中LncRNA FTH1P3可以通過招募賴氨酸特異性脫甲基酶1(LSD1)促進腫瘤的發生[6]。LncRNA FTH1P3通過調節口腔鱗狀細胞癌和葡萄膜黑色素瘤中的miR-224-5p增強細胞增殖和侵襲能力[12-13]。在口腔鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌中分別通過調控SP1/NF-κB、PI3K/AKT/GSK3β/Wnt/β-catenin信號通路發揮促癌作用，表明LncRNA FTH1P3在不同惡性腫瘤中發揮促癌因子的作用機制不同[7-8]。PI3K/AKT信號通路在胃癌中常處于激活狀態，在胃癌的惡性進展中發揮重要調控作用，在腫瘤信號的刺激作用下，PI3K蛋白發生磷酸化，pPI3K增多促使下游蛋白AKT蛋白的磷酸化，pAKT蛋白上調下游靶基因蛋白的表達促進腫瘤的增殖和轉移[14-15]。本研究Western blot結果顯示，LncRNA FTH1P3兩個干擾序列均抑制胃癌細胞中pPI3K和pAKT蛋白的表達，表明LncRNA FTH1P3可能是通過調控PI3K/AKT信號通路促進胃癌細胞增殖和遷移。

綜上所述，LncRNA FTH1P3在胃癌中高表達，與患者不良病理參數和預后有關。干擾LncRNA FTH1P3的表達會抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能是通過調控PI3K/AKT信號通路發揮作用。本研究對理解LncRNA FTH1P3在胃癌中的重要作用邁出了重要一步，并提供了LncRNA FTH1P3在胃癌惡性進展中的作用的新見解。