基于A20FMDV2-Gd-Cy5.5分子探針評價整合素αVβ6參與的胰腺癌血管形成機制研究

郝利國 崔 瑩 谷弘謙 孟凡盛 趙添羽 劉雅楠 孟 鑫

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院影像設(shè)備與技術(shù)學(xué)教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

胰腺癌患者(Pancreatic cancer,PC)是作為惡性腫瘤之一,臨床預(yù)后明顯較差且患者五年的生存率均僅能接近5%。在胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中，整合素αvβ6的表達上調(diào)，αvβ6整合素雖在正常胰腺組織中的基本不表達或很少表達，且約94%的PDAC患者表達αvβ6整合素[1]。RGD作為整合素的特異性配體提取自細(xì)胞外基質(zhì)，具有粘附性、介導(dǎo)性、飽和性和穩(wěn)定性四種特性。大量研究證實[2-5]，將全部或部分的RGD主肽鏈設(shè)計成環(huán)狀可以大大提高RGD在體內(nèi)的穩(wěn)定性，不僅可以提高RGD與整合素結(jié)合的能力，而且可以顯著提高其生物學(xué)特性。Zhou等以β-環(huán)糊精連接的POSS納米金屬顆粒作為載體,將整合素αV和β6分子中的特異性配體RGD序列分別與釓劑分子相互作用而合成c RGD-POSS-βCD-(DOTA-Gd)分子探針[6]。國內(nèi)外已有研究表明,過度表達的整合素αvβ6在多種消化道腫瘤的進展過程中有著極其重要的作用,并提示抑制αvβ6的表達極有可能阻斷腫瘤的進展[7-10]。A20FMDV2肽標(biāo)記為18F和64Cu能夠用于PET顯像[11-13]。盡管68Ga在胰腺導(dǎo)管腺癌PDAC成像中具有較高的特異性，很多二、三線城市不具備PET檢測條件，因此68Ga探針很難普及應(yīng)用，不利于胰腺癌患者的早期篩查。

1 資料與方法

1.1.1一般資料

由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物中心實驗室提供家兔模型12只,成功地制備出惡性占位小鼠模型(胰腺癌)共12只。EDC-HCl、NHS、硼砂、8k(Da)透析袋、Cy5.5、封口膜、PAMAM(G4-COOH)

1.1.2儀器

儀器產(chǎn)地(商家)激光粒度測定儀美國PSS透射電子顯微鏡日本日立粒度分析儀美國PSS電感耦合等離子體質(zhì)譜-質(zhì)譜儀美國集熱式磁力攪拌器上海力辰數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器江蘇正基小動物活體成像儀美國珀金埃爾默多功能酶標(biāo)儀奧地利

1.2研究方法

1.構(gòu)建分子探針及體內(nèi)外功能驗證

合成納米粒子，SEM檢測該分子探針的粒徑大小;利用DLS檢測出其水合粒徑及zeta電位變化等信息;多功能酶標(biāo)儀檢測熒光耦合效應(yīng)。運用熒光成像系統(tǒng)及 3.0T MR 成像系統(tǒng)觀察 EP管中 探針熒光及磁共振成像能力；不同濃度的G4-Gd2O3-Cy5.5納米團簇顆粒置于EP管中：用泡沫固定架使其直立置于MRI頭頸線圈內(nèi)進行掃描。采用 CCk8 法檢測探針體外細(xì)胞毒性；采用健康裸兔模型檢測探針體內(nèi)急性毒性。運用激光共聚焦顯微鏡驗證探針的體外細(xì)胞靶向性：將Panc-1細(xì)胞株與分子探針共孵育，洗去多于探針后觀察熒光分布特點并與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果比較。移植瘤模型隨機分為靶向組及非靶向組，分別經(jīng)尾靜脈注射 RGD-Gd-Cy5.5(靶向組)及Gd-DTPA(非靶向組)；分別于注射前及注射后在3.0TMRI下行T1加權(quán)成像，在獲得的圖像上將腫瘤及其相鄰的正常組織作為感興趣區(qū)域(ROI)測量信號強度，計算磁共振圖像的信噪比(SNR)并比較兩組圖像的SNR。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

對未進行配置對數(shù)據(jù)采集的數(shù)據(jù)進行t檢驗，數(shù)據(jù)用加權(quán)平均值和±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。P的值<等于0.05被一般認(rèn)為是具有重要統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形貌與尺寸

納米團簇顆粒的不同梯度濃度配比，在直立靜止放置24h后，各EP管顏色梯度明顯，無渾濁沉淀和分層現(xiàn)象。動態(tài)光散射法數(shù)據(jù)顯示:水動力尺寸實驗中納米團簇探針顆粒的平均水動力尺寸分布為(78.0±3.5)nm,團簇探針粒的平均尺寸粒徑分布相對較窄,表明粒徑尺度分布較為協(xié)調(diào)統(tǒng)一(圖1);測量得其zeta電位范圍為(-29.5±3.4)mV,穩(wěn)定性亦較好。

圖1 (左)、圖2(右)

經(jīng)數(shù)據(jù)帶公式(1)計算后得,Co:測試溶液元素的相對濃度,為1.16 (mg/L)。C1:樣品消解液中原液中的元素濃度,帶入公式(2)可得C1濃度值為29.17 (mg/L),與EDS能譜數(shù)據(jù)結(jié)果相似。

公式(1)公式(2)

紫外分光光度計檢測探針納米團簇顆粒，在400～700nm波段突出一個吸收峰，范圍集中在650nm左右，與Cy5.5吸收峰相同，表明花菁素偶聯(lián)成功。

2.2體內(nèi)安全性檢驗

家兔在VX-2組織懸液種植后，攝食量、飲水量、毛色未見明顯異常，體重由接種VX-2前的(2.12±0.34)kg降至(1.95±0.22)kg(如圖2)。主要靶臟器組織進行了HE染色檢測和肝臟組織病理學(xué)等檢查,結(jié)果均未見其他明顯組織異常。

2.3細(xì)胞毒性實驗

CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖3)，在所描述的濃度范圍內(nèi)，任何一種納米顆粒作用24小時都沒有明顯的細(xì)胞毒性，提示這些納米顆粒對ASPC-1細(xì)胞的毒性較小(p>0.05)，表明這些納米顆粒對ASPC-1細(xì)胞沒有明顯的毒性作用(p>0.05)。

圖3(左)、圖4(右)

2.4磁共振成像以及靶向性實驗

在T1序列的表現(xiàn)下提示，隨著探針納米團簇顆粒的濃度的升高，T1信號強度逐漸增強(圖4)。感興趣區(qū)域(ROI)測量信號強度，結(jié)果顯示，靶向組的信號強度明顯強于非靶向組。3.討論 近年來,我國居民癌癥總體發(fā)病率趨勢和惡性腫瘤死亡率,并未出現(xiàn)明顯下降趨勢[6]，國內(nèi)中國病人的惡性腫瘤新發(fā)病比例與總死亡病人例數(shù)比均遠(yuǎn)超過達到了世界平均數(shù)的近25%[7]。以核醫(yī)學(xué)、MRI、光學(xué)、超聲等單模態(tài)的分子探針，和以上多種結(jié)合多模態(tài)的分子探針層出不窮[8]。然而各種分子探針的載體選擇以及合成產(chǎn)率仍然是主要問題。本研究通過構(gòu)建雙模態(tài)分子探針A20FMDV2-Gd-Cy5.5，特異性結(jié)合整合素αvβ6分子成像，驗證αvβ6中β6胞內(nèi)功能段和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK2之間存在的生理性連接，驗證整合素αvβ6通過FAK依賴的途徑激活FKs，參與腫瘤新生血管的形成，進而參與細(xì)胞的增殖和遷徙，探索αvβ6調(diào)控胰腺癌細(xì)胞形成的作用機制，分析αvβ6在胰腺癌惡性生物學(xué)行為中的作用過程。本研究將在此研究的基礎(chǔ)上，進一步整合Gd和Cy5.5，建立雙模態(tài)成像探針，擬通過在低成本下實現(xiàn)對PDAC整合素αvβ6進行成像。我們課題組合成的納米探針,具有良好的生物安全性和穩(wěn)定性，成像效果較好，有利于為胰腺癌的早期診斷提供新的思路。