體外模擬消化對鮮切蘋果皮渣黃酮類物質及其還原力的影響

常 虹，王 爽，周家華，李文生，王云香，王寶剛,

（1.北京市農林科學院農產品加工與食品營養研究所，北京 100097；2.果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，北京 100097；3.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093）

蘋果因其口感爽脆多汁，酸甜可口，且具有美容養顏安神、增強記憶、提升智力等作用，所以又被稱為“智慧果”，深受各個年齡段人群的喜歡；我國蘋果的產量和消費水平均位居世界前列。隨著消費水平的提高，鮮切蘋果迅速發展起來，鮮切蘋果方便、快捷、新穎，并富含多種抗氧化活性物質，受到了消費者的青睞，在家庭消費及餐飲行業特別是快餐和配餐行業中廣受歡迎。目前在歐美等發達國家和地區已經實現鮮切蘋果的規范化和系統化生產，在鮮切產品消費中占有重要地位，在我國的發展前景也極為可觀。

鮮切蘋果是供消費者或餐飲行業即食的輕度加工產品，因此對原料的成熟度、含糖量及營養成分含量等要求高，宜選擇不容易軟化、粉質化品種如富士等，蘋果皮渣產量約占蘋果總量的20%～30%，大量皮渣被廢棄或填埋，造成資源浪費。皮渣中含有甚至超過果肉的營養成分，除了豐富的膳食纖維外，還有酚類物質、黃酮類物質和二十八烷醇等物質，蘋果中將近一半的V也在緊貼果皮的部位。黃酮類成分是蘋果皮渣的最主要成分，主要包括黃烷醇類、黃酮醇類、二氫查耳酮類等，其總含量為834.2～2300.3 mg/kg，遠高于果肉中15～605.6 mg/kg 的含量，且具有很高的藥用價值，對于預防心血管疾病、冠心病等慢性疾病有一定的治療效果。因此鮮切蘋果皮渣具有極強的利用價值。

近幾年，生物活性物質和營養成分的體外模擬消化研究受到國內外的廣泛關注。相對于體內消化，體外模擬胃、腸等的消化更為簡單、易行、有效，可以在一定程度上反映食品、藥品等在體內的變化規律，易于控制，省時省力，常用來分析食品、藥品及活性物質消化前后結構變化、生物利用度及消化率等。目前關于富含黃酮類物質的鮮切蘋果皮渣這一加工副產物的消化過程變化報道較少。本文嘗試通過體外模擬胃腸消化方法，評價鮮切蘋果皮渣黃酮粗提物在消化過程中含量及還原力的變化規律，以期對鮮切蘋果皮渣黃酮進行更加全面科學的判斷和評價，為鮮切蘋果加工副產物在醫藥、食品以及保健品等行業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋果 產地為新疆，市售；胃蛋白酶（30000 U/g）、胰酶（4000 U/g）、-淀粉酶（4000 U/g）生化試劑，上海源葉生物技術有限公司；氫氧化鈉、氯化鈣、氯化鈉、硝酸鋁、氯化鉀、三氯乙酸、碳酸氫鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、三氯化鐵、無水乙醇等 均為國產分析純。

SpectraMax iD3 多功能酶標儀 美國分子儀器公司；HZC-250 型恒溫振蕩培養箱 上海巴玖實業有限公司；JA5002 電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；LGJ-10F 真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；CP225D 分析天平 SARTORIUS公司；MDF-382E（N）型超低溫冰箱 日本三洋公司；DR04 型冷柜 青島海爾特種電冰柜有限公司；蘋果自動去皮切瓣機 北京燕誠集團；SY-1000E 多用途恒溫超聲波提取機 北京弘祥隆生物技術開發有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取方法 蘋果經過鮮切生產線上的自動去皮切瓣機后收集皮渣。將皮渣速凍后，進行真空冷凍干燥處理，干燥后的皮渣打粉，過100 目篩備用。根據前期預實驗結果，取蘋果皮渣粉末與85%乙醇，料液比為1:15（w/v），置于恒溫超聲波提取機中，超聲功率600 W，40 ℃超聲60 min，冷卻后抽濾，再將濾渣按上述條件重復提取1 次，合并濾液。將濾液真空濃縮，濃縮比例為30:1（體積比），然后-80 ℃保存備用。

1.2.2 體外模擬消化 體外模擬消化包括口腔、胃消化和腸道消化三部分。先進行口腔和胃消化，然后進行腸消化。

1.2.2.1 消化液的配制 模擬唾液：配制-淀粉酶/CaCl溶液，將0.00918 g-淀粉酶和0.015 g 無水氯化鈣加水定容至100 mL。

體外模擬胃液：在500 mL 胃電解質溶液中加入0.0135 g 胃蛋白酶，混合均勻后用1 mol/L HCl調pH 至2。稱取氯化鈉3.1 g、氯化鉀1.1 g、氯化鈣0.15 g、碳酸氫鈉0.6 g，溶解后定容至1 L，配制成胃電解質溶液。

體外模擬腸液：向100 mL 腸電解質溶液中加入同體積的胰酶溶液，搖勻，調節pH 至7（用1 mol/L NaHCO調節）。稱取5.4 g 氯化鈉、0.65 g 氯化鉀、0.33 g 氯化鈣，溶解后定容至1 L，配制成腸電解質溶液。胰酶溶液：7 g 胰酶溶于100 mL 去離子水，6000 r/min 離心10 min，取上清待用。

1.2.2.2 模擬口腔和胃消化 參照文獻[22-23]的方法并稍做改進。將黃酮提取液分別稀釋1、2、4 倍，配成高、中、低濃度，分別取1 mL，加入-淀粉酶/CaCl溶液（模擬唾液），混勻后在37 ℃恒溫培養箱中振蕩10 min（模擬口腔消化），然后加入體外模擬胃液10 mL（酸對照組為黃酮中濃度稀釋液，不添加胃蛋白酶的胃電解質溶液，調節pH 為2；空白對照組為黃酮中濃度稀釋液，不調節pH 的胃電解質溶液），調節樣品組pH 為2，然后于37 ℃恒溫搖床150 r/min 進行胃消化，分別于消化0、0.5、1、2 h 后取樣，6000 r/min 離心10 min，取上清液于-80 ℃保存備用。

1.2.2.3 模擬腸消化 參照文獻[13,23]的方法并稍做改進。將上述不同稀釋倍數黃酮提取液經過模擬口腔和胃消化后，在消化液中加入體外模擬腸液10 mL（空白對照組為黃酮中濃度稀釋液，加入腸電解質溶液，不添加胰酶），開始模擬腸道消化階段。調節樣品組和空白對照組的pH 至7.2（用1 mol/L NaHCO調節），然后置于恒溫搖床中150 r/min、37 ℃進行消化培養，分別于0、0.5、1、2、3、4 h 取樣，6000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存備用。

1.2.3 黃酮含量的測定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法取0.5 mL 樣品液，加入5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL，靜置6 min 后加入0.15 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入4% NaOH 溶液2 mL，加蒸餾水定容至5 mL，振蕩混勻，靜置3 min，在508 nm 處測定吸光值。以蘆丁為標準品，測定黃酮總含量。

1.2.4 還原能力的測定 采用普魯士藍法，移取0.5 mL 模擬胃、腸消化液，依次加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）1.25 mL 和1%的六氰合鐵酸鉀溶液1.25 mL，50 ℃水浴20 min，快速冷卻，再加入10%三氯乙酸1.25 mL，3000 r/min 離心10 min，移取上清液1.25 mL，依次加入1.25 mL 蒸餾水，0.1%三氯化鐵溶液0.25 mL，振蕩搖勻，靜置10 min，在波長為700 nm 處測定其吸光值。

1.3 數據處理

數據用三次平均值±SD 表示。采用 SPSS22.0對數據進行單因素方差統計分析（ANOVA），LSD 檢驗，以＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 模擬消化對鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響

2.1.1 體外模擬胃消化 體外模擬胃消化過程中鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的變化情況如圖1、圖2 所示。

圖1 體外模擬胃消化對不同濃度鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響Fig.1 Effect of in vitro simulated gastric digestion on flavonoid release from fresh-cut apple residue at different concentrations

圖2 體外模擬胃消化中胃蛋白酶對鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響Fig.2 Effect of pepsin on flavonoid release from fresh-cut apple residue in vitro simulated gastric digestion

由圖1 可見，三種不同濃度的黃酮提取液在相同模擬胃消化環境中發生的整體變化趨勢均表現為含量上升。胃消化過程中，不同濃度間黃酮含量差異顯著（＜0.05）。1 倍稀釋組在消化0.5 h 以后釋放量開始顯著上升（＜0.05），1 h 達到最大值，而后釋放量略有下降；2 倍稀釋組和4 倍稀釋組黃酮含量在1 h后顯著上升（＜0.05），證明隨著胃消化時間延長，黃酮是一個持續緩慢釋放的過程。

圖2 所示，胃消化階段，胃液消化組、酸對照組和空白組三組的變化趨勢。有胃蛋白酶的胃液消化組和無胃蛋白酶的酸對照組，采用中濃度黃酮提取液（即2 倍稀釋）黃酮含量在模擬胃消化過程中顯著增加（＜0.05），逐漸趨于穩定，空白組在消化過程中黃酮含量下降后趨于穩定，這表明胃蛋白酶和胃酸對黃酮的釋放均具有一定的促進作用，且加有胃蛋白酶的胃消化模擬體系中皮渣黃酮含量高于無胃蛋白酶的酸消化模擬體系，說明胃蛋白酶對黃酮釋放的促進作用高于酸對照組。

胃消化過程中，黃酮釋放量的顯著升高可能是由于部分蛋白質在胃蛋白酶的作用下水解，使得被大分子蛋白質包埋的黃酮類物質被釋放出來；也可能是胃蛋白酶的作用使多酚-蛋白質結構遭到破壞，多酚脫離蛋白質分子的束縛；黃酮類物質屬于多酚中具有高抗氧化活性的一類物質，含量增加還可能是胃蛋白酶減弱了部分酚酸與細胞壁間的酯鍵，使酚酸從細胞壁中脫離。而酸性環境同樣有此類效果，例如野櫻莓、黑果枸杞中多酚的體外消化試驗也發現酶解和pH 變化更易于使多酚類物質由結合態變為自由態。

2.1.2 體外模擬腸消化 體外模擬腸消化過程中鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的變化情況如圖3 和圖4 所示。

圖3 體外模擬腸消化對不同濃度鮮切蘋果皮渣粗提液黃酮釋放量的影響Fig.3 Effect of in vitro simulated intestinal digestion on flavonoid release of crude extracts of fresh-cut apple residue from fresh-cut apple residue at different concentrations

圖4 體外模擬腸消化中胰酶對鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響Fig.4 Effect of pancreatic enzymes on the release of flavonoids from fresh-cut apple residue in vitro simulated intestinal digestion

經模擬胃環境消化后，進入模擬腸消化階段。由圖3 可知，鮮切蘋果皮渣黃酮在腸道消化過程中，呈現先緩慢增加后下降的趨勢。不同濃度間，腸消化過程中黃酮含量差異顯著（＜0.05）。高、中、低濃度的蘋果皮渣黃酮粗提物的含量在腸消化2 h 后顯著上升（＜0.05），2～3 h 黃酮含量達最大值，分別是腸消化開始時（0 h，即胃消化反應后但未進行腸消化時）的1.24、1.59、3.15 倍。

如圖4，對比發現相同濃度的黃酮粗提液經過相同的胃消化模擬環境，空白組（即無胰酶環境）的粗提液黃酮含量與腸消化液組（有胰酶環境），均呈現先上升再下降的趨勢，腸液消化組的黃酮含量高于空白組。腸消化過程中，3 h 之前腸消化組黃酮含量高于空白對照組，且在0、0.5、2.0 h 時黃酮含量沒有顯著性差異（＞0.05），3 h 時腸液消化組顯著高于空白組（＜0.05）。在消化的第3 h左右達到峰值，后緩慢降低。對比得出，有胰酶的腸模擬溶液一定程度可以促進黃酮釋放。隨著消化時間的延長，酯鍵可能被水解或部分黃酮降解，因而使黃酮含量在腸消化后端降低。

腸消化過程中，黃酮釋放量的顯著升高可能是由于部分蛋白質在胰酶的作用下水解，使得被大分子蛋白質包埋的黃酮類物質被釋放出來；腸液消化組的酶可能作用于結合態的黃酮類物質，中性或偏堿性黃酮（如槲皮素等）可以在腸液介質中釋放，并穩定存在。而腸消化后期隨著酸性黃酮（如黃烷-3-醇等）大量降解或發生異構，釋放的黃酮低于降解的黃酮，從而使黃酮總量降低。

2.2 體外模擬消化過程中鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液還原能力的變化

2.2.1 體外模擬胃消化 體外模擬胃消化對鮮切蘋果皮渣粗提物還原能力的影響見圖5 和圖6。

圖5 體外模擬胃消化對不同濃度鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.5 Effect of in vitro simulated gastric digestion on the reducing ability of crude extracts of fresh-cut apple residue at different concentrations

圖6 體外模擬胃消化中胃蛋白酶對鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.6 Effect of pepsin on the reducing ability of fresh-cut apple residue crude extract in vitro simulated gastric digestion

從圖5 可以看出，在模擬胃消化過程中，其還原能力逐漸升高，并趨于穩定，這與黃酮釋放量的變化規律基本一致。不同濃度間，胃消化過程中還原力差異顯著（＜0.05），濃度越高，總還原力越強。2 倍稀釋組和4 倍稀釋組在0.5 h 的還原能力就顯著高于0 h（＜0.05），1 倍稀釋組在消化1 h 的還原能力顯著高于0 h（＜0.05）。

由圖6 可知，模擬胃液消化和酸消化后鮮切蘋果皮渣黃酮的總還原力均提高。胃液消化組（pH=2，有胃蛋白酶）和酸對照組（pH=2，無胃蛋白酶）的還原能力顯著高于空白對照組（＜0.05）。胃消化1 h 時胃液消化組和酸對照組的總還原力分別是空白對照組的1.39 倍和1.29 倍。而胃液消化組的還原力在1 h 以后又高于酸對照組，說明酸性條件和胃蛋白酶均有利于鮮切蘋果皮渣黃酮抗氧化活性的發揮，胃液消化對還原力的增強能力大于酸消化?？赡苁怯捎诮Y合型黃酮類物質在體外經酸水解、酶水解等方式破壞酯鍵、醚鍵等得以釋放，使其表現出較強的生物活性（還原性），因此消化后具有較高的保健價值。

2.2.2 體外模擬腸消化 體外模擬腸消化對鮮切蘋果皮渣黃酮粗提物還原能力的影響見圖7 和圖8。圖7 所示，模擬腸道消化環境中，隨著消化時間的延長，各組還原能力呈先增加再降低的趨勢。腸消化1 h 以內，三組濃度的總還原力均無顯著變化，各濃度之間還原力差異顯著（＜0.05），在消化2～3 h時，各組樣品均呈現還原能力增強的趨勢；鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液濃度越大，其還原能力也隨之增大。

圖7 體外模擬腸消化對不同濃度鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.7 Effect of in vitro simulated intestinal digestion on the reducing ability of crude extracts of fresh-cut apple residue at different concentrations

圖8 體外模擬腸消化中胰酶對鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.8 Effect of pancreatic enzymes on the reducing ability of fresh-cut apple residue crude extract in vitro simulated intestinal digestion

由圖8 中可以看出，整個腸消化過程中，腸液消化組（有胰酶）的還原能力一直高于空白組（無胰酶），且消化1 h 后該趨勢更為顯著（＜0.05）。腸液消化組還原力呈現先升高后降低并趨于平穩，而空白組的還原能力1 h 后略有升高，3 h 后顯著下降（＜0.05），說明胰酶對鮮切蘋果皮渣黃酮的還原能力有一定的增強作用。

黃酮類化合物以黃烷為母核，羥基的數量和位置都極大地影響了其抗氧化能力。蘋果果實類黃酮達34 種，分屬黃烷醇、黃酮醇、花青苷、二氫查耳酮和二氫黃酮醇5 類，總還原力的變化可能與黃酮物質的結構及含量的變化有關，胃腸環境的變化也影響黃酮類物質的結構和抗氧化活性的發揮。另外，抗氧化活性也是體系中所有抗氧化物質發揮協同和拮抗作用的結果。

3 結論

在模擬胃、腸消化過程中，鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量均有顯著升高（＜0.05），還原能力增強。在模擬胃消化中，胃蛋白酶和酸性環境對黃酮的釋放和黃酮還原力均有促進作用，鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液濃度越大，還原力也越大；在模擬腸消化中，胰酶可以在一定程度上促進黃酮的釋放，同時對還原能力也有增強作用，且鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液濃度越大，腸道中黃酮的還原力也越大。

任何一種生物活性物質在發揮其作用之前，都要經過人體的胃腸道消化，而消化也會對黃酮類化合物的生物活性產生影響。通過體外模擬腸胃消化法可以評價鮮切蘋果皮渣在胃腸消化模擬過程中黃酮含量和其粗提液還原能力的變化規律。但體內環境相當復雜多變，還受到原料品種、取樣位置等的影響，因此可通過進一步的動物實驗、人體實驗等進行驗證探究。