超聲處理對蕓豆蛋白理化性質及抗氧化能力的影響

周欣雨，佐兆杭，王 穎,2,3,4, ，么 楊 ，孫 維，張乃丹，龐惟俏

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319；5.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081）

隨消費者生活方式和膳食結構的改變，植物性蛋白倍受青睞。研究發現增加植物蛋白有助于預防糖尿病、增強心肺功能和抑制腫瘤細胞。蕓豆作為食用豆中的主要品種之一，種植范圍廣，成本低，廣泛被應用于食品加工。蕓豆的蛋白質含量豐富（23%），含脂量低，具有很高藥用和保健價值，心臟病和高脂血癥患者食用優選，且蕓豆蛋白多肽的抗氧化活性較高，可提高機體免疫能力，抑菌和抗病功效突出。然而，因蕓豆蛋白表面電荷低，水溶性差，導致蛋白質在水溶液中不穩定，使蕓豆蛋白不能全面滿足工業生產的需要。因此，利用綠色、環保的物理技術，來改變蛋白質的理化性質，從而提高人們對植物蛋白的利用率是十分必要的。

超聲波技術被公認為一種實用高效的提取技術，與熱工藝不同，超聲波在食品蛋白行業的實施更簡單、更快、更便宜，能耗更低，設備污染更低，操作條件更便利、無菌。隨著超聲處理產生的空化作用和機械作用，導致分子間鍵的斷裂和重新形成，可降低液滴尺寸，提高乳液穩定性，改變蛋白質溶解度等，如改變豌豆蛋白、大豆蛋白的乳化性等性能，已廣泛應用于食品工業。但目前豌豆蛋白、大豆蛋白的研究主要是超聲對其理化及結構特性的影響，對蛋白質不同超聲條件以及超聲前后抗氧化能力鮮有報道。本研究以蕓豆蛋白為原料，研究了超聲處理對蕓豆蛋白理化及抗氧化能力的影響，旨為拓寬蕓豆蛋白的應用領域，為蕓豆蛋白在相關功能性食品的研發與加工中提供理論依據及數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蕓豆蛋白（蛋白質量分數90%） 三原天域生物制品有限公司；T-AOC 試劑盒、鐵離子還原力試劑盒 上海博湖生物科技有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸 上海碧云天生物技術有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷 天津光復科技發展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美國Sigma 公司；以上試劑 均為分析純。

AR2140 電子天平 常州勵岸寶機械設備科技有限公司；DL-360B 型超聲波清洗機、FD-1A-50 型冷凍干燥機、JIDI-18D 型臺式多用途高速離心機上海之信儀器有限公司；UV759 型紫外分光光度計愛來寶醫療科技有限公司；PHS-3C pH 計 上海精密科學儀器有限公司；NLM100 均質機 上海人和科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲處理蕓豆蛋白樣品的制備 參考Tomotake等的方法制備超聲后蕓豆蛋白樣品，略有改動。20 g 蕓豆蛋白粉溶解于100 mL 蒸餾水中并攪拌均勻，分別作用于不同超聲功率（160、400 W），不同超聲時間（10、20、30 min），樣品為A、A、A、B、B、B。超聲結束將樣品平鋪放入容器中，-80 ℃冰箱凍12 h 后通過凍干機干燥成粉末，于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 蕓豆蛋白水解度測定 利用鄰苯二甲醛（OPA）法對蕓豆蛋白進行水解度測定。用紫外可見光分光光度計測定其吸光度（340 nm），吸光度要在精準反應2 min 后測定。按照下列公式進行計算：

式中：0.9516 meqv/L：去離子水固定參數；OD：吸光度；h：水解的肽鍵數；h：總肽鍵數，（蕓豆蛋白為7.42 mmol/g）；SerineNH：毫摩SerineNH/g 蛋白；X：待測樣品重量（g）；P：待測樣品濃度（g/mL）；、：分別用常數1.00、0.40 表示。

1.2.3 蕓豆蛋白溶解度測定 取0.5 g 蕓豆蛋白粉加入30 mL 去離子水，500 r/min 下攪拌1 h，8000 r/min離心15 min，取上清液，微量凱氏定氮法測定蛋白含量。溶解度為上清液中蛋白質含量占總蛋白質量濃度的百分比度。

1.2.4 蕓豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量測定 將10 mmol/L 5,5'-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶解在0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液（2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）中得到Ellman’s 試劑。取50 μL DTNB 緩沖液與2 mL 濃度為0.01 g/mL 的樣品溶液混合，25 ℃避光反應30 min。紫外分光光度計測定吸光度（412 nm），以緩沖液為空白，測定游離巰基含量。在測定總巰基含量時，將適量的蛋白質樣品溶解于尿素-Tris-甘氨酸緩沖液（10 mol/L 尿素，2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）和-巰基乙醇（-Me；加入50 μL），搖勻后在25 ℃暗室孵育60 min。8000 r/min 離心20 min，將得到的上清溶于5 mL 濃度為12%的TCA（w/v）中，重復3 次。離心后將沉淀溶解于2.5 mL 的Tris-甘氨酸溶液中，加入50 μL DTNB，25 ℃避光孵育30 min。最后，用紫外分光光度計在412 nm 處測量吸光度。巰基含量的計算公式如下：

式中：A為樣品在412 nm 處減去空白后的紫外吸光度值；D 為樣品稀釋倍數；C 為樣品濃度（g/mL）；二硫鍵含量由總巰基含量減去游離巰基含量再除以二得到。

1.2.5 蕓豆蛋白乳化性及乳化穩定性測定 乳化性及乳化穩定性的測定參考Wu 等報道的方法，用磷酸鹽緩沖液溶液（0.1 mol/L，pH7.0）配制蕓豆蛋白溶液，使蛋白的質量濃度為0.2%，蛋白溶液與大豆油的體積比為4:1，配置好溶液后，利用均質機使其形成乳狀液（1000 r/min，1 min），均質液靜止0 和10 min后從離心管底部0.5 cm 處取50 μL 漿液，并加入5 mL質量分數為0.1%的SDS 溶液中制成混合液，振蕩混勻，在500 nm 處測定混合液吸光度。0 min 時混合液的吸光度值記為A，10 min 時混合液的吸光度值為A，以0.1%的SDS 溶液做空白對照，計算公式如下：

式中：θ 表示乳化液中的油相體積分數（25%）。

1.2.6 蕓豆蛋白起泡性及起泡穩定性測定 配制100 mL 蛋白質量分數為5%的蛋白分散液，均質（8000 r/min，2 min），均質20 s 停頓20 s，然后快速轉入量筒中，記錄剛轉入量筒的泡沫體積V，并分別記錄在2、30 min 時泡沫的體積為V、V。

1.2.7 蕓豆蛋白抗氧化能力測定

1.2.7.1 蕓豆蛋白總抗氧化能力測定 取0.5 g 蕓豆蛋白粉加入50 mL 去離子水中，混合均勻。采用TAOC 試劑盒測定。

1.2.7.2 蕓豆蛋白DPPH 自由基清除能力測定 參考張雪春等的方法略有改動。乙醇為溶劑配制濃度為2×10mol/L 的DPPH 自由基溶液，于4 ℃冰箱保存備用。取0.5 mL 濃度為0.01 g/mL 樣品溶液，加入4 mL DPPH 自由基溶液混勻，室溫靜置30 min。利用紫外分光光度計測定其吸光值A（517 nm）；同時取4 mL 2×10mol/L DPPH 自由基溶與0.5 mL 60%乙醇混勻，測定其吸光值A，計算公式如下:

1.2.7.3 蕓豆蛋白鐵離子還原能力測定 取0.5 g 蕓豆蛋白粉加入50 mL 去離子水中，混合均勻。使用鐵離子還原力試劑盒進行測定。

1.3 數據處理

實驗均進行三次重復，結果以平均值±標準偏差表示。利用Excel、SPSS 22.0 等進行數據的處理和分析，采用Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對蕓豆蛋白水解度的影響

超聲處理對蕓豆蛋白水解度的影響如圖1 所示。與未處理組相比，蕓豆蛋白水解度隨著超聲功率與時間的增加而提高，當超聲時間20 min、功率400 W（B）時蕓豆蛋白的水解度增強效果最顯著（＜0.05），由3.34%增加至20.10%。分析是由于超聲處理產生的空化效應改變了蛋白質結構，使包埋在蛋白質內部的活性部位暴露，增加了底物與活性部位的結合，使蛋白質水解度提高，這一結果與杜雙奎等研究一致。但當超聲功率不變，時間繼續增加時（B），水解度開始下降，分析是由于超聲時間過長，使蕓豆蛋白暴露在外的與底物結合的活性部位被破壞，導致水解度開始降低。

圖1 不同超聲條件對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on protein hydrolysis degree of kidney bean

2.2 超聲處理對蕓豆蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質的重要性質之一。如圖2 所示，當超聲時間10 min、功率160 W（A）時，蕓豆蛋白溶解度變化并不顯著（＜0.05），在A（20 min，160 W）至B（20 min，400 W）時，蕓豆蛋白溶解度隨著超聲時間及功率的增加而顯著提高（＜0.05），在B時蛋白溶解度達到最大值79.43%。超聲產生的空化作用與機械效應可將蛋白質聚集體顆粒發生解聚現象，使蛋白質聚集體粒徑降低，增強蛋白質與水相互作用，從而增加蛋白質溶解度。當超聲功率不變，時間繼續增加時（B），蛋白質溶解度發生下降現象，分析是超聲時間過長導致蛋白質的解聚體重新聚集，溶解度減小。Zhong 等指出，在不同溫度和時間加熱時對綠豆蛋白的溶解度影響不大；相反，在熱與超聲共同作用下，隨處理溫度和時間增加，蛋白質溶解度逐漸增加，由此超聲也被認定是蛋白質溶解度增加的主要原因。

圖2 不同超聲條件對蕓豆蛋白溶解度的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on protein solubility of kidney bean

2.3 超聲處理對蕓豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響

圖3 表示了不同超聲強度處理蕓豆蛋白中游離巰基與二硫鍵含量的變化。由圖3 可知，隨超聲強度增加，蛋白中游離巰基的含量顯著提高（＜0.05），二硫鍵的含量顯著降低（＜0.05）；與未處理組相比，超聲時間20 min、功率400 W（B）時游離巰基的含量最高、二硫鍵含量最低，分別由3.95 μmol/g 增加至7.45 μmol/g、由2.91 μmol/g 減少至1.31 μmol/g。分析是因超聲使蛋白質分子顆粒減小，進而內部機構發生了改變。Hu 等研究表明，超聲處理會破壞蛋白質內二硫鍵，分解成新游離巰基。因此，本實驗中超聲處理使蛋白質內部的巰基暴露與二硫鍵的斷裂，降低了蛋白質分子的穩定性，從而使蕓豆蛋白的游離巰基的含量增加與二硫鍵的減少。但在當超聲功率不變時間延長時，蛋白中游離巰基的含量變少，二硫鍵含量增多，分析是蛋白質所含游離巰基在長期暴露于極性環境中易與二硫鍵重新結合，導致游離巰基的減少與二硫鍵增多。

圖3 不同超聲條件對蕓豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on content of freegroup and disulfide bond in kidney bean protein

2.4 超聲處理對蕓豆蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

乳化性是指超聲通過改變蛋白質的二級結構，使之部分變性，從而暴露疏水基團使之相互作用解離，促進分子在小顆粒表面擴散，從而更好地吸附油水界面上的油滴，乳化穩定性越高，則表示乳化性質越好。如圖4 所示，超聲后蕓豆蛋白的乳化及乳化穩定性顯著增加（＜0.05），超聲時間10 min、功率400 W 時蕓豆蛋白的乳化性最佳，由2.66 m/g 增加至5.49 m/g，乳化穩定性最好，由51.68%增加至70.11%，但當超聲功率不變，時間繼續增加時，乳化及乳化穩定性開始下降。這是由于超聲時間過長會使蛋白質嚴重變性，蛋白質小顆粒重新聚集成大顆粒從而降低了乳化性。大量研究發現，超聲處理可以有效地改善蛋白質的乳化性及乳化穩定性等功能性指標。

圖4 不同超聲條件對蕓豆蛋白乳化性及乳化穩定性的影響Fig.4 Effects of different ultrasonic conditions on sulfhydryl emulsification and stability of kidney bean protein

2.5 超聲處理對蕓豆蛋白起泡性及起泡穩定性的影響

由圖5 可知，超聲處理對蕓豆蛋白起泡性及起泡穩定性差異顯著（＜0.05），在超聲時間10 min、功率400 W 時蕓豆蛋白的起泡性和起泡穩定性達到最大值，分別由88.13%增加至162.81%，由65.24%增加至72.94%。分析是超聲波產生的空化作用使蕓豆蛋白分子聚集程度降低，蛋白質疏松，從而蕓豆蛋白更容易吸附在氣-水界面上，增加了蕓豆蛋白的起泡性及起泡穩定性。望運滔等研究，隨超聲強度增加，鷹嘴豆蛋白的起泡性顯著增強（＜0.05），超聲處理20 min 時，達到最大值136.7%，是未處理組的2.3 倍。但當超聲功率不變、時間延長時，蕓豆蛋白的起泡性及起泡穩定性數值下降，這是由于超聲時間過度，蛋白質疏松結構變得緊密，使起泡性及起泡穩定性出現降低的現象。因此，適當的超聲處理能夠有效的提高蕓豆蛋白的起泡性及起泡穩定性。

圖5 不同超聲條件對蕓豆蛋白起泡性及起泡穩定性的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic conditions on foamability and foamability stability of kidney bean protein

2.6 超聲處理對蕓豆蛋白抗氧化能力的影響

蕓豆蛋白的抗氧化能力如圖6 所示。由圖6 可知，超聲處理前后蛋白抗氧化能力差異顯著（＜0.05），在超聲時間10 min、功率400W（B）時，蕓豆蛋白總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力與Fe 離子還原能力分別達到最大值，總抗氧化能力由323.60 U/mL增加到636.28 U/mL；DPPH 自由基清除能力由49.70%增加至87.28%；Fe 離子還原能力由62.74%增加至80.58%。研究人員發現超聲處理會加速蛋白質疏水性氨基酸外露，使蛋白質疏水性與水解度增加，而蛋白質的抗氧化能力與疏水性與水解度成正比。由此說明，超聲處理增加蛋白質的疏水性與水解度，從而增加了蕓豆蛋白的抗氧化能力。這也與上述試驗中水解度增加的趨勢相符。當超聲功率不變，時間繼續增加時，蛋白的三種抗氧化能力指標數值開始下降，分析是超聲時間過長，暴露氨基酸基團重新被掩埋，水解度下降，繼而抗氧化能力降低。

圖6 不同超聲條件對蕓豆蛋白抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of different ultrasonic conditions on antioxidant capacity of kidney bean protein

3 結論

與未處理組相比，超聲處理顯著提高（＜0.05）蕓豆蛋白的溶解度、水解度、乳化性及乳化穩定性、起泡性及起泡穩定性，超聲處理使蕓豆蛋白游離巰基含量增加，二硫鍵含量減少。超聲處理提高了蕓豆蛋白抗氧化能力，總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力與Fe 離子還原能力三種指標數據均顯著提高（＜0.05）。但超聲時間過長也會引發蕓豆蛋白的理化性質數值與抗氧化能力下降，因此，適度超聲處理可以提高蕓豆蛋白理化性質及抗氧化能力。