人腸道來源霍氏腸桿菌4-2-1 的分離及其對枸杞多糖的發(fā)酵作用

王艷萍，方海田, ，胡海明，殷明珠，劉洪濤

（1.寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏銀川 750021；2.湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，湖北武漢 430065）

寧夏枸杞（L.）別名茄果，枸杞子，是我國備受喜愛的藥食同源食物，其中含有多種活性成分，主要包括多糖、多酚、類胡蘿卜素、萜烯類、有機酸以及多種微量元素。而多糖又是枸杞中最主要的活性成分之一，在免疫調節(jié)、抗氧化、抗疲勞、護肝等方面貢獻頗大。枸杞多糖與疾病的相互作用已成為關注的熱點。有研究表明，枸杞多糖不僅可以維持腸道微生物群的平衡，改善非酒精性肝病，而且能夠調節(jié)腸道菌群，減少壓力因素對后代情緒傷害的影響。

人體腸道是一個大型的發(fā)酵、消化場所。其中人體腸道菌群組成復雜、數量巨大，包括擬桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬等?；羰夏c桿菌屬于腸桿菌科，是存在與人和動物腸道內的正常菌株之一，現在國內對霍氏腸桿菌的研究較少，汪芳芳發(fā)現優(yōu)化霍氏腸桿菌A20 培養(yǎng)條件之后，葉黃素的降解率提高了20%左右，增加了葉黃素的商業(yè)價值，同時霍氏腸桿菌WM1 可以發(fā)酵碳水化合物產生青霉素酶，并在檢測牛奶中青霉素的殘留發(fā)揮一定作用。而人腸道菌群也不是固定不變的，與很多因素都有密切關系，比如年齡、環(huán)境、性別、飲食等多種因素，其中飲食被認為是改變腸道菌群最直接、最有效的方法之一。有研究表明，碳水化合物是人類飲食的主要成分，但其中的植物多糖不能被口腔、胃液吸收，只有被分解成小分子物質才能達到其益生元作用，而腸道微生物能夠定植在遠端腸道分解復雜碳水化合物，Fu 等人對鼠尾藻多糖的體外發(fā)酵研究中發(fā)現，鼠尾藻多糖只有被結腸微生物發(fā)酵后才能對人體發(fā)揮作用，亞麻籽多糖在被人類糞便微生物水解利用后才能有助于成為促進結腸的益生元。枸杞多糖是一種水溶性多糖，為含有多種微量元素和氨基酸的蛋白多糖，具有重要生理活性。而目前對枸杞多糖的發(fā)酵作用大多研究主要集中在糞便菌群的發(fā)酵上，對單菌和枸杞多糖之間的作用了解甚少。因此明確對枸杞多糖發(fā)揮作用的腸道單菌具有重要意義。

本研究從為了闡明腸道細菌在人體吸收枸杞多糖過程中的作用，通過形態(tài)學觀察，生理生化實驗以及16S rRNA 基因對其進行鑒定，篩選出一株腸道單菌株，最后將該單菌應用到枸杞多糖發(fā)酵中，通過對枸杞多糖發(fā)酵指標的研究，以揭示枸杞多糖在人體內的作用機制，為之后相關方面的研究提供一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人體腸道糞便 聯(lián)系3 位健康志愿者，要求志愿者無消化系統(tǒng)疾病，3 個月內未服用抗生素或益生菌；枸杞，購自寧夏銀川市中寧；枸杞多糖 由本實驗室制備得到。細菌基因組DNA 提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；苯酚、濃硫酸 國藥集團化學試劑有限公司，瓊脂糖 北京擎科生物科技有限公司。

BXM-30R 壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司；超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；V－5100 紫外分光光度計 上海精科實業(yè)有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；凝膠成像系統(tǒng) Eppendorf 公司；梯度PCR 儀 Eppendorf公司；LB 培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海生物技術有限公司；瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司；Spectra-Max iD3 多功能酶標儀 美谷分子儀器上海有限公司；S210 pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 無碳源SM 液體培養(yǎng)基：氯化鉀4.5 g/L、氯化鈉4.5 g/L、碳酸氫鈉1.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、氯化銨0.3 g/L、堿性微量元素（NaSeO0.087 g/L，NaWO0.165 g/L，NaMoO0.121 g/L，NaOH 2 g/L）1 mL/L、酸性微量元素（FeClZnCl、CuCl、HCl）1 mL/L，高溫高壓115 ℃滅菌15 min 后，按照500:1的比例加入CaCl母液，按照1000:1 的比例加入維生素溶液（維生素B、維生素B、維生素B、維生素B），配制固體培養(yǎng)基所需瓊脂粉為20 g/L。

1.2.2 人糞便樣品預處理 稱取一定質量新鮮人類糞便，在超凈工作臺中加入無菌PBS 進行渦旋，500 r/min 離心5 min，吸上清至滅完菌的離心管中，再加入無菌PBS 旋渦，500 r/min 離心5 min，再次吸上清至滅完菌的Ep 管中，得到糞便懸液。糞便懸液一部分用于實驗，剩余部分加入無菌厭氧甘油，分裝，保存在-80 ℃，備用。

1.2.3 人體糞便中菌的富集 取一定量糞便懸液，500 r/min 離心5 min，棄去上清，用PBS 洗滌兩次后，離心重懸，按照合適的體積比，接種至LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.4 腸道菌分離篩選 將1.2.3 富集的樣品用PBS溶液進行稀釋至10～10梯度，在LB 固體培養(yǎng)基中進行涂布，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24～36 h。挑選培養(yǎng)基中不同顏色、形狀和大小的菌株至LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h。將液體培養(yǎng)基中得到的菌株在LB 固體培養(yǎng)基中反復劃線，已保證得到純度較高的單菌，將上述得到的單菌落以50%甘油進行保菌，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.5 菌株發(fā)酵能力的比較 將經過反復劃線得到的兩株單菌按照1:50 的比例加入含有枸杞多糖的SM 液體培養(yǎng)基中，放置在37 ℃搖床中搖床培養(yǎng)72 h，測量發(fā)酵液中多糖含量的變化。

1.2.6 菌株鑒定 將1.2.4 中得到對枸杞多糖發(fā)酵能力較好的菌株4-2-1 進行鑒定。根據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌系統(tǒng)分類學手冊》對分離出的細菌進行細菌形態(tài)和生理生化鑒定。

采用16S rRNA 基因進行分子生物學鑒定，以4-2-1 菌株的基因組為模板進行PCR 擴增，正反向引物為8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反應體系（50 μL）為：模板DNA 1 μL，KOD 酶1 μL，10×KOD buffer 5 μL，dNTP（2 mmol/L）5 μL，引物（F+R）3 μL，MgSO（25 mmol/L）3 μL，ddHO 22 μL。PCR 擴增參數設置為：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延將。得到的PCR 擴增產物進行1%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳。確認聚合酶反應擴增片段，若PCR 擴增產物在1500 bp 左右，則可送至上海生工進行測序，將該16S rDNA 序列遞交NCBI進行BLAST 同源序列檢索，比較篩出菌株與已知菌株的系統(tǒng)發(fā)育關系和系統(tǒng)地位，如果同源性大于99%，則確認為同一類細菌，借助Mega X 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 霍氏腸桿菌4-2-1 對枸杞多糖發(fā)酵的影響將枸杞多糖（2 mg/mL）加入無碳源的SM 固體培養(yǎng)基中，使得枸杞多糖成為培養(yǎng)基中的唯一碳源，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中對菌株4-2-1 培養(yǎng)至有明顯菌落。并接種至含枸杞多糖的無碳源SM 液體培養(yǎng)基中，放置37 ℃搖床中培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)后吸取1 mL 的菌液，的以3000 r/min 進行離心3 min，收集菌體并用PBS 稀釋至1 mL，按照1:50 的比例將霍氏腸桿菌接種至以枸杞多糖為唯一碳源的SM 液體培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，動態(tài)監(jiān)測發(fā)酵過程中細菌生長含量（OD）、pH 的變化、多糖含量、還原糖含量以及分子量變化。

1.2.7.1 發(fā)酵過程中菌株生長曲線測定 將菌株按照1:50 的比例加入含有枸杞多糖為唯一碳源的SM液體培養(yǎng)基中，放置在37 ℃搖床中搖床培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、48 h 取樣，用紫外分光光度計測每個時間點的OD，實驗在相同條件下重復三次。

1.2.7.2 發(fā)酵過程中pH 測定 將菌株加入含有枸杞多糖為唯一碳源的的SM 液體培養(yǎng)基中，放置在37 ℃搖床中搖床培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、48 h 取樣，用pH 計測每個時間點的pH，以按照1:50 的比例接種霍氏腸桿菌4-2-1 的SM 液體培養(yǎng)基作為對照組，實驗在相同條件下重復三次。

1.2.7.3 發(fā)酵過程中多糖含量測定 硫酸-苯酚法測定發(fā)酵液中多糖含量，參考Masuko 等方法略作修改。取各個時間段的發(fā)酵液，13000 r/min 離心3 min，取上清，分別吸取0.3 mL 不同時間點發(fā)酵樣品溶液和葡萄糖標準溶液加入0.2 mL 的6%苯酚溶液，震蕩搖勻后迅速加入1 mL 濃硫酸，搖勻加塞后置于沸水浴放置20 min，取出后用涼水冷卻10 min；用酶標儀進行測定，在波長為490 nm 處測定吸光度，以葡萄糖濃度X 為橫坐標（μg/mL），OD為縱坐標，繪制標準曲線，并根據標準曲線Y=0.02200X+0.04749，=0.9997 計算樣品中總碳水化合物含量。

1.2.7.4 發(fā)酵中還原糖含量測定 采用二硝基水楊酸（DNS）法測定發(fā)酵液中還原糖，參照牟佳紅等方法略作修改。分別吸取0.4 mL 不同時間點發(fā)酵樣品溶液和葡萄糖標準溶液，加入DNS 試劑0.8 mL，搖勻后置于恒溫混勻儀100 ℃加熱5 min，取出后置于冰水混合物中冷卻至室溫，用酶標儀進行測定，在波長為540 nm 處測定吸光度，以葡萄糖濃度X 為橫坐標（mg/mL），D為縱坐標，繪制標準曲線，并根據標準曲線Y=1.54300X+0.04671，=0.9991 計算樣品還原糖含量含量。

1.2.7.5 發(fā)酵過程中多糖分子量測定 分子量的測定參照唐雨薇方法略作修改。發(fā)酵產物使用80%的乙醇進行4 ℃過夜沉淀，并用0.22 μm 濾膜過濾。采用Wasters-2424 蒸發(fā)光檢測器測定多糖的分子量，檢測條件：色譜柱：GE 水溶性凝膠柱（7.8 mm×300 mm）；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；流動相：純化水；霧化器模式：加熱（90%功率，36 ℃）；載氣：N；氣流壓力：0.28 MPa；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3 數據處理

實驗均重復三次取平均值，實驗結果均用平均值±標準差來表示，采用Mega X 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，用統(tǒng)計學分析軟件SPSS 進行顯著性分析，Excel 2019 進行數據統(tǒng)計并分析，由Graph Pad Prism 8 軟件進行實驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵能力較優(yōu)菌株的篩選

通過反復劃線可得純度較高的兩株細菌，將菌株3-2-1 和菌株4-2-1 接種至含枸杞多糖的無碳源SM 液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)基中多糖含量的變化，無碳源SM 培養(yǎng)基作為對照組。由圖1 可知，發(fā)酵72 h 后，與對照組相比，兩個發(fā)酵組多糖含量明顯降低，說明這兩株菌均可以利用枸杞多糖，并且菌株4-2-1 的發(fā)酵能力強于3-2-1，因此選擇發(fā)酵能力較優(yōu)菌株4-2-1 進行后續(xù)實驗。

圖1 菌株篩選過程中多糖含量的變化Fig.1 Changes in polysaccharide content during strain screening

2.2 人腸道菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 采用三區(qū)劃線法將4-2-1 在LB 固體培養(yǎng)基上劃線。通過對4-2-1 菌株形態(tài)學觀察，發(fā)現菌株4-2-1 在LB 培養(yǎng)基平板上生長情況如圖2，圓形，邊緣透明，中間呈乳白色，有光澤，略隆起，邊緣整齊；對4-2-1 菌株進行革蘭氏染色后發(fā)現，該菌周身鞭毛運動，無芽孢，無夾膜，通過革蘭氏染色初步判定4-2-1 為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下成桿狀。

圖2 菌株4-2-1 的形態(tài)學特征Fig.2 Morphologic characteristics of strain 4-2-1

2.2.2 16S rRNA 擴增結果 利用引物對所提取的基因組DNA 進行擴增，所擴增的結果如圖3 所示，在1500 bp 左右出現了目的條帶，條帶整齊，表明PCR 產物可用于測序分析。

圖3 1%瓊脂凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis diadram

2.2.3 4-2-1 系統(tǒng)進化樹分析 用Snap Gene Viewer軟件對4-2-1 測序序列進行拼接，借助NCBI 中的BLAST 和數據庫中已知菌株的16S rRNA 基因進行序列比對，用相似度最高的菌株來確定4-2-1 的種屬狀況。結果表明，菌4-2-1 的16S rRNA 基因序列與數據庫中已知霍氏腸桿菌的16S rRNA 基因的相似性大于99%。為了進一步明確該菌株與已知菌株的親緣關系及分類地位，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示該菌株與KK736258.1 在系統(tǒng)發(fā)育樹聚為一支，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4 所示。

圖4 菌株4-2-1 的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Enterobacter 16S rRNA gene sequence of strain 4-2-1

2.3 對枸杞多糖發(fā)酵的影響

2.3.1 發(fā)酵篩選及菌株生長特性 OD可以用來描述霍氏腸桿菌4-2-1 在含有枸杞多糖的培養(yǎng)基中的生長特性。而從圖5 可以發(fā)現，霍氏腸桿菌4-2-1 在36 h 后基本進入穩(wěn)定期，在0～12 h 處于對數生長期，達到平臺期時菌株的OD在0.15 左右。由此可知，霍氏腸桿菌4-2-1 可以在含枸杞多糖的培養(yǎng)基中很好的生長，并且存活率較高，所測結果和岳喜慶等篩選出霍氏腸桿菌的生長趨勢相似。

圖5 發(fā)酵液中菌株生長情況Fig.5 Growth of strains in fermentation broth

由上可知，細菌總量增長，說明霍氏腸桿菌4-2-1 能在含枸杞多糖的唯一碳源培養(yǎng)基中生長。

2.3.2 霍氏腸桿菌4-2-1 發(fā)酵枸杞多糖過程中pH、多糖含量、還原糖含量的變化 在發(fā)酵過程中，檢測多糖含量、還原糖含量和pH 的動態(tài)變化。如圖6（a）所示，多糖的初始含量在682 μg/mL 左右，此后，在12 h 的發(fā)酵期間內，多糖含量逐漸降低，逐漸趨于穩(wěn)定，剩余多糖含量在205.7 μg/mL 左右，之前也有研究表明，多糖含量的變化與糞便微生物的作用息息相關。同樣的，還原糖也由剛開始的最高含量逐漸降低，直到24 h（圖6（b））。通過發(fā)酵后多糖和還原糖的分解程度，說明霍氏腸桿菌4-2-1 可在枸杞多糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行生長。

圖6 發(fā)酵過程中不同時間點的特征指標測定Fig.6 Measurement of indicators at different time points

多糖在腸道里可以被腸道菌選擇利用，引起pH的變化，因此，pH 是反應發(fā)酵過程的一個重要指標。如圖6（c）所示，發(fā)酵12 h 后，發(fā)酵組的pH 從7.98 降至7.79，在24 h 發(fā)酵結束時，降低至7.75 并保持穩(wěn)定。然而在整個發(fā)酵過程中，對照組的pH 保持不變，和之前的荔枝多糖作為益生元的研究相似。表明枸杞多糖可被腸道菌霍氏腸桿菌4-2-1 發(fā)酵利用，引起培養(yǎng)基相應pH 的變化，并可能產生相應的有機酸。

2.3.3 霍氏腸桿菌4-2-1 發(fā)酵枸杞多糖過程中枸杞多糖分子量變化 對發(fā)酵后枸杞多糖的分子量進行檢測，結果如圖7。在發(fā)酵的過程中，枸杞多糖的含量隨著霍氏腸桿菌的發(fā)酵時間推移而降低，分子量也從8.02 kDa 變?yōu)?.44 kDa，表明枸杞多糖在霍氏腸桿菌的發(fā)酵下被分解，由此可以推測，霍氏腸桿菌對于枸杞多糖在人體腸道的消化吸收發(fā)揮著重要的作用。

圖7 不同時間點枸杞多糖分子量測定Fig.7 Determination of molecular weight of Lycium barbarum polysaccharide at different time points

3 結論

多糖經微生物發(fā)酵后可以被人體利用并發(fā)揮有益作用。因此研究對枸杞多糖的發(fā)酵是了解枸杞多糖在體內作用的重要部分。本研究從人體糞便樣品中分離出一株對枸杞多糖具有很好發(fā)酵作用的霍氏腸桿菌4-2-1，檢測培養(yǎng)基中細菌生長曲線、pH 變化、多糖含量、還原糖含量和分子量變化。結果發(fā)現，該菌為革蘭氏陰性菌霍氏腸桿菌，能在以枸杞多糖為碳源的培養(yǎng)基中進行生長，且隨著發(fā)酵的進行，細菌數量顯著增加，導致發(fā)酵體系內pH 由7.98 變化至7.79，多糖含量、還原糖含量和多糖分子量發(fā)生變化，分別降低了30.2%、40.6%和42.9%，說明從人腸道糞便樣品中分離的霍氏腸桿菌4-2-1 能對枸杞多糖進行發(fā)酵。綜上，人腸道來源的霍氏腸桿菌4-2-1 可發(fā)酵枸杞多糖，這可能部分解釋了枸杞多糖作為益生元對機體健康的改善作用，為多糖的生理活性進一步提供依據，但詳細的機制還需要進一步研究。