超高壓輔助提取靈芝三萜的工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價

徐樹來，徐 瑤，尤婷婷，劉志彬，祝嗣臣

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076；3.黑龍江坤健農(nóng)業(yè)股份有限公司，黑龍江齊齊哈爾 161200）

靈芝（）屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、靈芝科（Ganodermataceae）、靈芝屬（）等。世界上已知的靈芝科有400 多個分類單元，中國已報道的靈芝科約有100 個分類單元。主要化學(xué)成分包括三萜類、多糖類、甾醇類、生物堿類、脂肪酸等，其中三萜化合物是靈芝中最重要的生物活性成分之一。研究表明，三萜類化合物具有抗衰老活性、抗腫瘤、降血糖、保肝護(hù)肝等多種藥理活性。在中成藥、保健食品及功能性食品領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用及開發(fā)價值。

國內(nèi)外學(xué)者對靈芝三萜提取的研究報道較多，有機(jī)溶劑浸提法相對簡單，但溶劑耗量大、提取時間長、效率較低；超臨界流體萃取法相對操作復(fù)雜且提取成本較高；超聲波輔助法及微波輔助法盡管高效省時，但對成分有一定影響，酶輔助提取法耗時長且酶易失活。而超高壓輔助提取法因其低溫、短時、高效，且不會破壞熱敏性活性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是最有前景的植物活性成分萃取方式之一。本文擬對靈芝三萜超高壓輔助提取及溶劑浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究不同提取方法對靈芝三萜抗氧化活性的影響，以期獲得較高的提取得率及對生物活性物質(zhì)保護(hù)更好的提取方法，為靈芝三萜的開發(fā)及綜合利用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤靈芝超微粉 黑龍江坤健農(nóng)業(yè)股份有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.72%） 成都曼斯特生物科技有限公司；無水乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；冰乙酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；香草醛（實(shí)驗(yàn)用） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究院；DPPH自由基 北京博奧托達(dá)科技有限公司；水楊酸 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸 天津政成化學(xué)制品有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 均為蒸餾水。

HPP-L2-600-L 超高壓設(shè)備 上海昔銳生物科技有限公司；UV-5200 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵上海力辰邦西儀器科技有限公司；BSM-120 分析天平 上海卓精電子科技有限公司；DZKW-S-6 電熱恒溫水浴鍋 天津天泰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝三萜提物制備 稱取干燥至恒重的靈芝超微粉1.000 g，根據(jù)后續(xù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計參數(shù)條件，按一定料液比加入不同濃度的乙醇進(jìn)行加熱提取或在一定壓力、時間下超高壓提取，提取結(jié)束過濾、合并濾液、定容，計算靈芝三萜得率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰乙酸法測定醇提物中總?cè)频臏y定方法，參考孫培龍實(shí)驗(yàn)方法并稍作修改，用紫外-可見分光光度計在450～700 nm 波長之間進(jìn)行掃描，得出吸光度最大吸收波長為548 nm，并以不同濃度齊墩果酸溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程為：y=46.824x+0.0183，=0.9988，具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3 總靈芝三萜得率測定 將抽濾所得的靈芝三萜提取液合并定容50 mL，取0.2 mL 沸水浴加熱揮干待測試管中的提取液，按1.2.2 測量吸光度，計算出醇提取液中總靈芝三萜得率：

式中: Y 為靈芝總?cè)频寐剩?；c 為待測樣品中總?cè)迫芤簼舛龋琺g/mL；v 為濾液定容后的體積，mL；m 為原材料靈芝粉末的質(zhì)量，g；v為試樣體積，mL。

1.2.4 超高壓輔助提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[13]設(shè)定各因素水平范圍分別為：乙醇濃度為（60%、70%、80%、90%、100%）；壓力為（250、300、350、400、450 MPa）；保壓時間在（1、3、5、7、9 min）；料液比為（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）。在常溫條件下，固定乙醇濃度80%、壓力350 MPa、保壓時間5 min、料液比1:20 g/mL，研究各因素對靈芝三萜得率的影響。

1.2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計 為進(jìn)一步確定超高壓提取靈芝三萜的最佳條件，進(jìn)行L（3）正交試驗(yàn)，因素水平編碼如表1 所示。

表1 超高壓輔助提取正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the UHP assisted extraction orthogonal experiments

1.2.5 有機(jī)溶劑浸提法實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[14-15]，設(shè)定各因素水平范圍分別為：乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）；料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）；提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）；提取時間（1、2、3、4、5 h）。固定化水平為乙醇濃度80%、料液比1:20 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時間3 h，研究各因素對靈芝三萜得率的影響。

1.2.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計 為進(jìn)一步確定有機(jī)浸提靈芝三萜的最佳條件，進(jìn)行L（3）正交試驗(yàn)，因素水平編碼如表2 所示。

表2 有機(jī)溶劑提取正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of the organic solvent extraction orthogonal experiments

1.2.6 靈芝三萜對DPPH 自由基清除率的測定 參照文獻(xiàn)[16]方法并稍作調(diào)整，精密吸取不同濃度的靈芝三萜溶液2 mL，加入2 mL DPPH 溶液，混合均勻，以維生素C 為陽性對照，室溫避光放置30 min后，于517 nm 處測吸光值。DPPH 清除率計算公式如下：

式中：Y為DPPH 清除率，%；A為以無水乙醇代替樣品時空白吸光度；A為為加入樣品反應(yīng)后的DPPH 自由基吸光度；A為以無水乙醇代替DPPH測定的吸光度。

1.2.7 靈芝三萜對羥自由基清除率的測定 參照文獻(xiàn)[17]方法并稍作調(diào)整，取不同濃度靈芝三萜溶液2 mL，依次加入1 mL 的9 mmol/L FeSO、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L HO，在37 ℃水浴下反應(yīng)30 min。在510 nm 下測定溶液的吸光值，按下式計算·OH 清除率：

式中：Y為羥自由基清除率，%；A為以蒸餾水2 mL 代替樣品時空白吸光度；A—為FeSO溶液、水楊酸-乙醇溶液、HO溶液各1 mL，樣品溶液2 mL 下的吸光度；A為以蒸餾水1 mL 代替HO時空白吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取均值，采用Excel 2010 和Origin 2018 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

圖1 試驗(yàn)結(jié)果表明，齊墩果酸在548 nm 波長處有最大吸收，且空白無干擾，故選548 nm 為測定波長。

圖1 最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength

2.2 超高壓輔助提取靈芝三萜工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 壓力對靈芝三萜得率的影響 由圖2a 可知，隨著提取壓力的升高，得率不斷提高，原因是壓力可以影響物質(zhì)的傳質(zhì)速率，進(jìn)而影響得率。當(dāng)壓力為350 MPa 時，得率達(dá)到最大值。而壓力繼續(xù)升高，得率反而降低，是因?yàn)檫^高的壓力會導(dǎo)致靈芝三萜有效成分結(jié)構(gòu)破壞，這與文獻(xiàn)[14]研究的結(jié)果基本一致，方差分析結(jié)果表明，壓力對得率具有顯著影響（＜0.05）。所以，選取壓力300～400 MPa 作為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。

2.2.1.2 乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響 由圖2b可知，乙醇濃度在60%～90%范圍內(nèi)，得率隨乙醇濃度的增大而提高；當(dāng)濃度增加至100%時，得率明顯下降。這是由于部分靈芝三萜結(jié)構(gòu)含有羥基，使得靈芝三萜帶有一定的極性，根據(jù)相似相溶原理，更溶于非極性或弱極性，方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度對得率具有顯著影響（＜0.05）。因此，選乙醇濃度85%～95%為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。

2.2.1.3 保壓時間對靈芝三萜得率的影響 由圖2c可知，當(dāng)保壓時間5 min 時，得率最高；隨著保壓時間繼續(xù)增加，得率趨于穩(wěn)定，表明提取進(jìn)入動態(tài)平衡狀態(tài)，且保壓時間過長會導(dǎo)致提取物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。與訾鴻威對靈芝三萜的研究結(jié)果相似，方差分析結(jié)果表明，保壓時間對得率具有顯著影響（＜0.05）。故選取保壓時間3～7 min 作為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。

2.2.1.4 不同料液比對靈芝三萜得率的影響 如圖2d可知，隨著料液比的增加，溶質(zhì)逐漸充分溶解，三萜得率逐漸增加；當(dāng)料液比為1:20（g/mL）時效果最好；而后略呈下降趨勢，與文獻(xiàn)[20]研究結(jié)果相似。Corrales 等研究表明增加料液比能降低原料顆粒周圍的提取物濃度，促進(jìn)目標(biāo)提取物的擴(kuò)散和溶出，有利于增加提取率。方差分析結(jié)果表明，料液比對得率具有顯著影響（＜0.05）。因此，選取料液比為1:15～1:25 g/mL 作為正交試驗(yàn)的水平范圍。

圖2 超高壓輔助提取各因素對三萜得率的影響Fig.2 Effect of different factors on the yield of triterpenoids assisted extracted by UHP

2.2.2 超高壓正交試驗(yàn)結(jié)果 按表1 進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如圖表3 所示。表3 中的極差R 分析表明，各因素主次順序?yàn)椋簤毫Γˋ）＞乙醇濃度（B）＞保壓時間（C）＞料液比（D），通過極差分析獲得最優(yōu)參數(shù)組合為ABCD，即壓力350 MPa、乙醇濃度90%、保壓時間為7 min、料液比為1:20 g/mL，為表3 中5 號實(shí)驗(yàn)。在此最優(yōu)提取條件下，做三次重復(fù)試驗(yàn)取均值，得出靈芝三萜的得率為1.154%，標(biāo)準(zhǔn)差為2.59%。

表3 超高壓輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of the assisted extraction by UHP

2.3 有機(jī)溶劑浸提工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 浸提溫度對靈芝三萜得率的影響 由圖3a所示，在50～80 ℃溫度范圍內(nèi)，得率隨溫度的提高而增大，這是由于溫度能提高目標(biāo)提取物的擴(kuò)散速率和溶解度，促進(jìn)有效成分的溶出，進(jìn)而提高得率；但當(dāng)溫度過高時，易導(dǎo)致熱敏性物質(zhì)的降解，并可能造成三萜類化合物結(jié)構(gòu)破壞，從而降低靈芝三萜的得率，而且溫度越高能耗越大。與鄭士彬等等研究結(jié)果相近。方差分析結(jié)果表明，溫度對得率具有顯著影響（＜0.05）。因此，選取溫度75～85 ℃為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。

2.3.1.2 提取時間對靈芝三萜得率的影響 由圖3b可知，在一定時間范圍內(nèi)適當(dāng)延長提取時間可以提高其得率；當(dāng)時間為2～3 h 時，靈芝三萜得率變化趨于穩(wěn)定，隨著提取時間的繼續(xù)增加，靈芝三萜得率下降；可能的原因是，隨著提取時間延長，增加溶劑中其他醇溶性成分的溶出，與三萜類物質(zhì)競爭溶劑，且時間過長，提取效率過低，和文獻(xiàn)[15]研究結(jié)果相近，方差分析結(jié)果表明，提取時間對得率具有顯著影響（＜0.05）。因此，選取時間2.5～3.5 h 為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。

2.3.1.3 乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響 由圖3c所示，當(dāng)乙醇濃度在60%～80%時，隨著乙醇濃度的增加三萜得率逐漸增加，而后靈芝三萜得率逐漸下降。原因是靈芝總?cè)瓶赡芤攒蘸蛙赵獌煞N形式存在，苷易溶于水，苷元易溶于醇，所以乙醇濃度過高或過低都不利于二者的提取。方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度對得率具有顯著影響（＜0.05）。圖中乙醇濃度80%～90%均處于高點(diǎn)區(qū)，本著高區(qū)選擇原則，選取乙醇濃度80%～90%為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。若選取75%～85%，則偏離了高點(diǎn)區(qū)域，可能會造成優(yōu)化結(jié)果的偏差。后續(xù)正交試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

圖3 有機(jī)溶劑浸提法各因素對三萜得率的影響Fig.3 Effect of different factors on the yield of triterpenoids extracted by the organic solvent method

2.3.1.4 料液比對靈芝三萜得率的影響 靈芝三萜提取得率的影響結(jié)果如圖3d 所示，其變化規(guī)律及原因與2.2.1.4 相似，并與袁媛研究結(jié)果相一致，不再贅述。方差分析結(jié)果表明，料液比對得率具有顯著影響（＜0.05），選取料液比為1:20～1:30（g/mL）為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平范圍。

2.3.2 有機(jī)溶劑浸提正交試驗(yàn)結(jié)果 由表4 極差R 分析可知，各主次因素依次為：浸提溫度（A）＞浸提時間（B）＞料液比（D）＞乙醇濃度（C），其最優(yōu)參數(shù)組合為ABCD，即浸提溫度為75 ℃、提取時間為3 h、乙醇濃度為90%、料液比為1:25（g/mL）。在此最優(yōu)提取條件下，做三次驗(yàn)證試驗(yàn)取均值，靈芝三萜得率為0.925%，標(biāo)準(zhǔn)差3.12%，均高于表4 中各項(xiàng)結(jié)果。

表4 有機(jī)溶劑浸提正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental results of the organic solvent extraction

由上述2.2 和2.3 的試驗(yàn)結(jié)果對比分析可以看出，超高壓輔助提取靈芝三萜優(yōu)于有機(jī)溶劑浸提法，原因是其提取原理不同。超高壓是利用100～1000 MPa的冷等靜壓，改變細(xì)胞的滲透性，提高傳質(zhì)速率，促進(jìn)被提取物的溶出，從而提高提取得率及效率；陳瑞戰(zhàn)通過對比超高壓和回流對人參根粉末的影響，發(fā)現(xiàn)在短時間里細(xì)胞器及胞內(nèi)物質(zhì)被破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得松散，空隙率增大，解釋了超高壓提取得率及效率更高的原因；而有機(jī)溶劑浸提是利用物質(zhì)的相似相溶原理，通過加熱溶解擴(kuò)散，將活性物質(zhì)溶于有機(jī)溶劑的過程，其速度慢、效率低。因此，超高壓輔助提取得率更高，效果更好。

2.4 不同提取方法靈芝三萜浸提液抗氧化性結(jié)果

2.4.1 靈芝三萜對DPPH 自由基清除率 如圖4 所示，隨著靈芝三萜濃度的增加，其DPPH 自由基清除能力均逐漸增強(qiáng)。在濃度為3 mg/mL 時，超高壓輔助提取法DPPH 自由基清除率為59.64%±2.44%，IC達(dá)到1.8 mg/mL；而有機(jī)溶劑浸提法DPPH 自由基清除率僅為41.87%±2.72%，且未達(dá)到IC抑制水平。可見，超高壓靈芝三萜提取液DPPH 自由基清除能力優(yōu)于有機(jī)溶劑浸提液。

圖4 靈芝三萜對DPPH 自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of Ganoderma lucidum triterpenes on DPPH free radical

2.4.2 靈芝三萜對羥自由基清除率 由圖5 可知，隨著靈芝三萜溶液濃度的增加，其羥自由基清除率不斷提高。在濃度為3 mg/mL 時，超高壓輔助提取法羥自由基清除率高達(dá)62.31%±1.57%，IC達(dá)到2 mg/mL；而有機(jī)溶劑浸提在3 mg/mL 時最大清除率僅為43.36%，且未達(dá)到IC抑制水平。表明在提取液濃度相同的情況下，超高壓靈芝三萜提取液清除羥自由基的能力高于有機(jī)溶劑浸提液。

圖5 靈芝三萜對羥自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of Ganoderma lucidum triterpenes on hydroxyl radicals

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，相同濃度條件下，超高壓提取的靈芝三萜抗氧化活性更強(qiáng)，對DPPH 自由基的和羥自由基的清除率均高于有機(jī)溶劑浸提液。其原因主要有兩個：一是超高壓提取是在室溫條件下進(jìn)行的，避免了高溫對熱敏性成分帶來的不利影響，有利于保護(hù)天然產(chǎn)物的生物活性；二是超高壓獨(dú)特的作用機(jī)理，使其對小分子物質(zhì)（如皂甙、黃酮、生物堿等）的分子結(jié)構(gòu)沒有影響或影響很小，可有效保護(hù)靈芝三萜的生物活性；而有機(jī)溶劑浸提法，提取溫度高、時間長，對生物活性成分影響大，因此，靈芝三萜超高壓浸提液抗氧化性優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提液，說明超高壓輔助提取更有利于保護(hù)靈芝三萜生物活性。

綜上所述，超高壓輔助提取法比有機(jī)溶劑浸提法提取得率更高，三萜抗氧化活性更強(qiáng)。同時，超高壓輔助提取法具有低溫、高效，適于熱不穩(wěn)定物質(zhì)提取等優(yōu)點(diǎn)，有望在未來天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對靈芝三萜超高壓提取和有機(jī)溶劑浸提進(jìn)行了工藝優(yōu)化和體外抗氧化活性研究，確定了超高壓輔助提取靈芝三萜的最佳工藝為：壓力為350 MPa、料液比1:20 g/mL、保壓時間7 min、乙醇濃度90%，三萜得率為1.154%；有機(jī)溶劑浸提法的最佳工藝為：料液比1:25 g/mL、乙醇濃度90%、提取溫度75 ℃、提取時間3 h，三萜得率為0.925%。抗氧化性研究結(jié)果表明：超高壓提取液在濃度為3 mg/mL 時，對DPPH 和羥自由清除率分別為59.64%±2.44%，62.31%±1.57%，IC分別是1.8 和2.0 mg/mL，而同濃度有機(jī)溶劑浸提液僅為41.87%±2.72%、43.36%±2.36%，未達(dá)到IC抑制水平，且靈芝三萜濃度與抗氧化活性呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。本文的研究結(jié)果表明，超高壓輔助提取法的提取得率及靈芝三萜抗氧化性均優(yōu)于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提法。當(dāng)然，這僅是本課題組階段性研究結(jié)果，還存在提取方法不夠全面，缺乏靈芝三萜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果支撐，尚無法十分清楚地揭示其作用機(jī)理等不足，課題組正在有序開展后續(xù)研究工作，以期為靈芝的深加工及綜合利用提供更有力參考和支撐。