紅棗及其制品鏈格孢毒素的QuEChERSUPLC-MS/MS 檢測方法建立及其污染分析

魯玲玲，范盈盈，張銳利,

（1.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，新疆烏魯木齊 830002）

紅棗是新疆最具有資源優勢和發展潛力的特色產業，同時也是支撐南疆地區農業經濟發展的重要支柱。近年來，由鏈格孢屬真菌引起的“黑斑病”成為新疆紅棗產業最主要病害；其真菌毒素污染給消費者對紅棗及其制品的食用帶來安全恐慌。因此，掌握紅棗中鏈格孢毒素的種類、含量及污染水平，是保障南疆紅棗產業持續穩定發展急需解決的問題。

2003 年美國農村部Michelangelo 等研究人員開發的QuEChERS 主要應用于農產品中農藥及獸藥殘留檢測的快速樣品前處理。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）是一種快速、便捷、低成本、高效率、穩固且安全的前處理技術，原理與高效液相和固相萃取相似，都是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，從而達到凈化提取的目的。隨著分析檢測技術的不斷發展，QuEChERS 技術逐漸被改良并應用在其他微量、痕量化合物的分析檢測中。由于鏈格孢毒素的種類、含量的不確定性，為其準確檢測帶來較大影響。超高效液相色譜串聯一級質譜或二級質譜方法具有靈敏度好、準確度高、無需對樣品進行柱前衍生、檢測周期短等優點。近年來，將QuEChERS 前處理技術與UPLCMS 相結合應用于農產品中真菌毒素檢測的報道越來越多，但將其應用于紅棗及其制品中鏈格孢毒素檢測的報道甚少。

為掌握紅棗及其制品中鏈格孢毒素的污染分布情況，本文探究了以QuEChERS 為基礎的紅棗鏈格孢毒素提取技術，建立了UPLC-MS 檢測方法。針對南疆四個主要紅棗產區的原料紅棗和市售紅棗制品進行鏈格孢毒素種類和含量的分析檢測。以期為紅棗及其制品的食用安全性評估奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料紅棗 2021 年11 月采集自新疆阿克蘇、和田、喀什地區未經加工處理的駿棗，果形飽滿、呈圓柱形或長倒卵形，果面深紅色，無霉爛、漿頭，無不熟果，無病果、蟲果；紅棗制品 當地特產超市，詳情見表1；細交鏈孢菌酮酸（TeA，CAS: 610-88-8）、交鏈孢酚（AOH，CAS: 641-38-3）、交鏈孢酚單甲醚（AME，CAS: 26894-49-5）、騰毒素（TEN，CAS: 28540-82-1） 純度≥98%，新加坡Pribolab 公司；交鏈孢霉烯（ALT，CAS: 889101-41-1） 純度≥98%，加拿大TRC公司；乙腈、甲醇 色譜純，Fisher Chemical；無水硫酸鎂、氨水（分析純）、甲酸、冰乙酸（色譜純） 福晨（天津）化學試劑有限公司；氯化鈉、碳酸銨 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

表1 紅棗制品信息Table 1 Informations of jujube products

Oasis HLB 6 cc（500 mg）LP Extraction Cartridge 固相萃取柱 上海安譜實驗科技股份有限公司；聚醚砜膜（PES）、聚四氟乙烯膜（PTFE）、尼龍膜（Nylon）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）過濾膜 直徑 13 mm，孔徑 0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司；Vion IMS QTof MS 超高效液相色譜-高分辨質譜、Waters Vac 6 cc（500 mg）Alumina B Cartridges固相萃取柱 美國Waters 公司；Milli-Q 超純水儀美國Millipore 公司；MS205DU電子分析天平Mettler Toledo 公司（中國上海）；MTS 240C 自動水平振蕩器 上海達姆實業有限公司（中國上海）；MS3 Basic 漩渦振蕩器 德國IKA 公司；JW-100S 超聲波清洗器 深圳創美清洗設備有限公司；Eppendorf Centrifuge 5415D 高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司；PHS-2F pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司（中國上海）；RE-52A1L 旋轉蒸發儀 濟南泰醫生物技術有限公司（中國濟南）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 1 mg/mL 標品儲備液的制備：準確稱取TEA、AOH、AME、TEN、ALT 5 種毒素標品各0.0010 g 分別置于5 支1 mL 棕色容量瓶中，加乙腈定容，于-20 ℃冰箱中密封保存。

100 μg/mL 儲備液的制備：吸取1 mg/mL 的TEA、AOH、AME、TEN、ALT 5 種毒素儲備液各0.2 mL，置于同一棕色2 mL 容量瓶中，加乙腈定容，于-20 ℃冰箱中密封保存。

標準工作液：分別吸取相當體積的100 μg/mL儲備液，用乙腈稀釋配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/mL 的5 種鏈格孢毒素標準工作液，于-20 ℃冰箱中保存。

基質工作液：濃度設置與標準工作液相同，以不含毒素的樣品空白基質稀釋配制。

1.2.2 毒素提取

1.2.2.1 QuChERS 方法提取固體樣品中毒素 固體樣品破碎處理后稱取2.5 g 置于50 mL 離心管中，依次加入10 mL 超純水和10 mL 乙腈（含1%乙酸），放入自動水平振動器在2500 r/min 條件下振蕩提取5 min 使紅棗樣品均勻分散。隨后立即加入4 g無水硫酸鎂和1 g 氯化鈉，渦旋振蕩30 s。將離心管配平后放入冷凍高速離心機在8000 g 條件下離心10 min，取適量上清液在40 ℃水浴中旋轉蒸發至近干，加入1 mL 乙腈-甲醇-甲酸混合溶液（乙腈:甲醇:甲酸=70:29:1，v:v）復溶，樣液經0.22 μm PTFE濾膜過濾，等待上機測定。

1.2.2.2 固相萃取方法提取液體樣品中毒素 取10 mL液體樣品，用甲酸調整pH 至2.5，固相萃取小柱（以5 mL 甲醇和5 mL 超純水活化），樣液分兩次注入，注意始終保持柱內填充物被液體覆蓋，不能讓液體流干，流速控制在1 mL/min；待樣品過柱完畢后，依次用5 mL 超純水和5 mL 甲醇-水溶液（甲醇:水=4:6，v:v）淋洗，棄去此前所有過柱的混合液。準備干凈的試管收集洗脫液，先向固相萃取小柱中加入5 mL 甲醇，再加入5mL 含1%氨水的甲醇-乙腈溶液（甲醇:乙腈=1:1，v:v），減壓抽干5 min 后將收集的洗脫液于40 ℃水浴中氮吹至近干，加1 mL 10%甲醇-水溶液復溶，0.22 μm PTFE 濾膜過濾，等待上機檢測。

1.2.3 超高效液相色譜條件 Acquity UPLC HSS C（2.1×100 mm，1.8 μm）色譜柱；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相：A 為0.1 mmol/L 碳酸銨水溶液，B 為純甲醇；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min、20% A；4～5.5 min、100% A；5.6～8 min、20% A。

1.2.4 串聯質譜條件 串聯質譜采用電噴霧離子源（ESI），多反應監測掃描（MRM）。離子源溫度為150 ℃，電離電壓4 kV，脫溶劑氣流量350 L/h，脫溶劑溫度350 ℃，碰撞氣流量150 L/h，錐孔反吹氣流量30 L/h。5 種鏈格孢毒素所用質譜參數詳見表2。

表2 質譜參數Table 2 Mass spectrum parameters

1.2.5 基質效應 分別以標準溶液溶劑和樣品空白基質配置100 μg/mL 5 種鏈格孢毒素混合標準液。根據實際測定值，通過下式計算基質效應（ME）:ME=（A/B-1）×100%，式中：A 表示基質標準點峰面積；B 表示溶劑標準點峰面積。判別標準：當ME＞0時，代表基質增強效應；當ME＜0 時，代表基質抑制效應；當︱ME︱≤20%表示弱基質效應，當20%＜︱ME︱≤50%表示中等基質效應，當︱ME︱＞50%表示強基質效應。

1.3 數據處理

實驗數據通過超高效液相色譜-高分辨質譜儀配備的MassLynx 軟件下載獲取，采用Microsoft Office Excel 2010 和Origin 2021 統計學軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

為選擇適合于TeA、AOH、AME、TEN 和ALT 5 種鏈格孢毒素色譜分離的流動相組合，本試驗探索了以碳酸銨水溶液、甲酸銨水溶液、甲醇-甲酸水溶液3 種水相和乙腈、甲醇2 種有機相的6 組配比作為流動相時5 種鏈格孢毒素的色譜分離情況和峰形的對稱性。結果表明，當以甲酸銨水溶液、甲醇-甲酸水溶液分別與甲醇、乙腈組合作為流動相時，ALT 未見出峰，TeA 與TeN 呈長拖尾峰，分離效果較差，為使5 種鏈格孢毒素充分分離，將水相換成碳酸銨水溶液分別與乙腈、甲醇組合作為流動相，發現以碳酸銨水溶液和甲醇作為流動相時ALT、TeA、TeN 的出峰情況有所改善。進一步優化碳酸銨水溶液的濃度（1.0、0.5、0.1 mmol/L）以提高5 種鏈格孢毒素的豐度和靈敏度，當使用0.1 mmol/L 碳酸銨水溶液和甲醇作為流動相時5 種鏈格孢毒素的豐度最好，色譜峰充分分離。優化后的5 種鏈格孢毒素MRM 色譜圖見圖1。

圖1 鏈格孢毒素標準溶液MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of standard solution of Alternaria toxin

2.2 基質效應

為評價紅棗樣品中的基質效應，本試驗針對紅棗、紅棗酒及紅棗提取物展開基質效應分析。如表3，結果表明，紅棗中ALT 為中等基質減弱效應，TEN為中等基質增強效應；紅棗酒中TeA 為中等基質減弱效應，AOH 為弱基質增強效應；紅棗提取物中TEN 為強的基質減弱效應；AOH 為強的基質增強效應。由于紅棗和紅棗提取物中糖類物質較多，在色譜分離過程中待測成分的離子化效應被增強，提高了信號的響應程度，此時的定量檢測結果偏高；而紅棗酒中水分含量較高，待測成分在色譜分離過程中的離子化效應被弱化，抑制了信號的響應程度，此時的定量檢測結果偏低。這與易盛國等研究者：糖類、油脂、蛋白質等物質能增強基質效應，而含水量的增加在一定程度上抑制基質效應的報道一致。為補償樣品中的基質效應，保證定量檢測結果的準確性，本試驗采用空白基質配置標準曲線。

表3 鏈格孢毒素基質參數Table 3 Alternaria toxin matrix parameters

2.3 線性方程和相關系數

本研究試驗以樣品基質空白稀釋配置線性范圍在0.05～50 μg/mL 的5 種鏈格孢毒素標準溶液，以定量離子的相應峰面積為縱坐標（Y 軸）、相應的質量濃度為橫坐標（X 軸）建立標準曲線，所得線性回歸方程的相關性良好，相關系數均大于0.99，并根據信噪比（S/N=3）確定5 種鏈格孢毒素的LOD 和LOQ分別為0.13～86.19、0.61～259.53 μg/g，表明本方法具有較好的準確度和靈敏度，可滿足紅棗樣品中5 種鏈格孢毒素的定性定量檢測要求。線性回歸方程、相關系數等見表4。

表4 鏈格孢毒素線性范圍、回歸方程、相關系數、LODs、LOQs（n=5）Table 4 Linear range,regression equation,LOD,LOQ and correlation coefficient of Alternaria toxin (n=5)

2.4 QuEChERS 方法提取毒素

2.4.1 樣品量的確定 樣品量的選擇在一定程度上影響著實際測定值與真值間的相近程度。在稱量過程中天平的絕對誤差是固定的，因此樣品量越大，相對誤差越小；而超高效液相色譜-串聯質譜靈敏度高，樣品量不宜過大。為確定紅棗及其制品中鏈格孢毒素測定的樣品量，結合文獻報道的紅棗鏈格孢毒素既往分布情況，如圖2，本研究分別在2.5、5、10 μg/g 3 個加標水平下（n=5），考察了0.2、1.0、2.0、2.5和5.0 g 樣品量對5 種鏈格孢毒素回收率的影響。結果顯示：當樣品量取2.5 g 時，5 種鏈格孢毒素的加標回收率均大于75%，在可接受范圍，其中TeA 回收率最高達到86.91%。故本研究選擇2.5 g 為樣品的稱取質量。

圖2 樣品量對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.2 Effect of sample size on the recovery of Alternaria toxin

2.4.2 提取溶劑 在毒素提取過程中提取溶劑的選擇至關重要。鏈格孢毒素種類繁多，因化學結構不同性質各異，在水中的溶解度不盡相同，但大都易溶于有機溶劑。乙腈是極性非質子有機溶劑，溶解力強、洗脫力好、能兼顧化合物的不同化學性質；研究顯示酸性體系能提高鏈格孢毒素的提取效率。如圖3，為確定提取紅棗中鏈格孢毒素的溶劑，本實驗分別在2.5、5、10 μg/g 3 個加標水平下（n=5）考察了1.0%乙酸乙腈、1.5%甲酸乙腈和2.0%甲酸乙腈對5 種鏈格孢毒素加標回收率的影響，發現以1.0%乙酸乙腈作為提取溶劑時，AME 的回收率最高為85.82%，其余4 種毒素的3 個加標水平回收率在51.50%～81.22%。為提高紅棗中鏈格孢毒素的提取率，本研究提取溶劑選擇1%乙酸乙腈溶液。

圖3 提取溶劑對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvent on the recovery of Alternaria toxin

2.4.3 無水硫酸鎂用量 QuEChERS 方法中加入無水硫酸鎂的作用是去除有機物中的少量水分。如圖4，為確定無水硫酸鎂的具體用量，本研究試驗在5 μg/g 加標水平下，分別考察了不加無水硫酸鎂和加入2.5、4、5 g 無水硫酸鎂對5 種鏈格孢毒素回收率的影響。結果顯示，當無水硫酸鎂的用量為4 g 時，AOH回收率最高達86.53%，TEN 回收率最低為72.51%，AME、TEN 和ALT 回收率在75.22%～82.63%。當無水硫酸鎂的用量為5 g 時溶液過飽和，在復溶后的樣品中有鹽粒析出，增加了過濾時的阻力給后續工作帶來不便。因此本研究選定4 g 為無水硫酸鎂用量。

圖4 無水硫酸鎂用量對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.4 Effect of the amount of anhydrous magnesium sulfate on the recovery of Alternaria toxin

2.4.4 氯化鈉用量 在樣品前處理過程中加入氯化鈉可以加大水相化合物的密度，從而加快水相與有機相分離。如圖5，為確定氯化鈉的用量，本研究試驗在5 μg/g 加標水平下，分別考察了0.2、0.4、1 和1.5 g氯化鈉用量對5 種鏈格孢毒素回收率的影響。結果顯示，當氯化鈉用量為1 g 時，TeA 回收率最高為85.26%，ALT 回收率最低為67.41%，AOH 回收率為81.35%，TEN 回收率為66.41%，ALT 回收率為67.24%。本研究選擇氯化鈉用量為1 g。

圖5 氯化鈉用量對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.5 Effect of sodium chloride dosage on the recovery of Alternaria toxin

2.4.5 復溶溶劑 提取液經過旋轉蒸發至近干后，使用一定配比的有機溶劑對待測組分進行復溶可以恢復鏈格孢毒素的化學結構和活性，便于上機檢測。如圖6，為確定復溶溶劑的配比，本實驗研究在5 μg/g 加標水平下，分別考察了乙腈:甲醇=1:1、乙腈:甲醇:甲酸=70:29:1、乙腈:水=1:1 和甲醇:水=1:9 對5 種鏈格孢毒素回收率的影響。結果表明：當以乙腈:甲醇:甲酸=70:29:1 作為復溶溶劑時，AME 回收率最高達96.3%，ALT 回收率最低為64.93%，TeA、AOH 和TEN 回收率在82.67%～95.61%。因此本研究選擇乙腈:甲醇:甲酸=70:29:1 作為復溶溶劑。

圖6 復溶溶劑對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.6 Effect of redissolved solvent on the recovery of Alternaria toxin

2.5 固相萃取法提取毒素

2.5.1 固相萃取柱 固相萃取方法中萃取柱的選擇至關重要，根據待測組分的化學性質選擇相應填料的固相萃取柱能在去除雜質保留待測物質的同時提高待測物質的提取率。如圖7，為選擇合適的固相萃取柱，根據鏈格孢毒素性質和固相萃取柱填料，本研究在5 μg/g 加標水平下分別對比了HLB LP Extraction 固相萃取柱和Vac Alumina B 固相萃取柱對液體紅棗樣品中鏈格孢毒素回收率的影響，發現使用HLB LP Extraction 固相萃取柱凈化后的液體紅棗樣品中AOH 回收率最高為96.20%，TeA 回收率最低為79.63%，AME 回收率為95.47%，TEN 回收率為89.17%，ALT 回收率為94.23%。HLB LP Extraction 固相萃取柱對鏈格孢毒素的提取率高，準確性好，適用性強。這與邢家溧等研究人員報道的以HLB 小柱分離純化嬰幼兒奶粉中7 種鏈格孢霉毒素的回收率在73.1%～92.8%之間，效果略好于其他類型小柱，且HLB 小柱適用性強，在上樣過程中，小柱干涸不影響分離效果的結果相一致。

圖7 固相萃取柱對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.7 Effect of solid phase extraction column on the recovery of Alternaria toxin

2.5.2 過濾膜 作為過濾雜質保留待測組分的最后一道工序，過濾膜的選擇同樣影響測定結果的準確性。目前可用于樣品溶液過濾的濾膜種類較多，主要區別在于過濾膜的材質。如圖8，為盡可能減小系統誤差，探究過濾膜對鏈格孢毒素回收率的影響，本研究試驗分別使用聚醚砜膜（PES）、聚四氟乙烯膜（PTFE）、尼龍膜（Nylon）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）4 種過濾膜過濾加標水平為5 μg/g 的樣品溶液，發現使用PTFE過濾膜的AME 回收率最高為97.51%，ALT 回收率最低為67.64%，TeA、AOH 和TEN 回收率在82.93%～96.59%。PTFE 能在過濾雜質的同時最大程度保留待測組分，因此本研究選擇聚四氟乙烯膜（PTFE）作為過濾膜。

圖8 過濾膜對鏈格孢毒素回收率的影響Fig.8 Effect of filtration membrane on the recovery of Alternaria toxin

2.6 回收率和精密度

如表5，以不含5 種鏈格孢毒素的固體紅棗樣品和液體紅棗樣品作為本底，在2.5、5、10 μg/kg 三個加標水平下進行回收率試驗，每個加標水平重復測試5 次。結果表明，固體紅棗樣品中5 種鏈格孢毒素回收率在74.89%～98.04%，液體紅棗樣品中5 種鏈格孢毒素回收率在68.35%～99.83%，2 種形態紅棗樣品加標回收率的相對標準偏差均小于10%。本方法在2.5～10 μg/kg 標準添加量下均有較高的回收率，且精密度良好，能滿足紅棗中5 種鏈格孢毒素的檢測要求。

表5 紅棗樣品中鏈格孢毒素的加標回收率和精密度（n=5）Table 5 Recovery and precision of Alternaria toxin in jujube samples (n=5)

2.7 原料紅棗中鏈格孢毒素測定

對采集自新疆阿克蘇、喀什、和田地區三個主要紅棗產區的原料駿棗進行鏈格孢毒素測定。如表6，三個主要紅棗產區原料駿棗中共檢出2 種鏈格孢毒素，分別是TeA 和AOH，其中喀什地區原料駿棗中TeA的檢出率最高，達到99.22%，含量為5.12～10.76 μg/kg，這與程家興等研究報道中TeA 檢出率最高相一致。阿克蘇地區原料駿棗中AOH 的含量最高，達11.12～53.22 μg/kg；鏈格孢毒素AME、TEN 與ALT在三個主要紅棗產區的原料駿棗均未檢出。

表6 原料紅棗中鏈格孢毒素含量（n=5）Table 6 Content of Alternaria toxin in jujube (n=5)

2.8 紅棗制品中鏈格孢毒素測定

本實驗分別對凍干棗片、香酥脆棗、紫晶棗、紅棗酒、紅棗提取物中的鏈格孢毒素進行測定，如表7，結果顯示，凍干棗片中檢出鏈格孢毒素TeA 和ALT，這2 種毒素在凍干棗片中的平均含量分別為7.68、2.12 μg/kg；香酥脆棗中同樣檢出鏈格孢毒素TeA和ALT，平均含量分別為6.91、200.76 μg/kg；紫晶棗中檢出鏈格孢毒素TeA、AOH 和ALT，平均含量分別為7.03、75.17、92.65 μg/kg；紅棗酒中TeA 毒素含量在125.31～129.07 μg/kg 范圍內；紅棗提取物中 的TeA 毒素含量在121.73～132.86 μg/kg 范 圍內。在所檢5 種紅棗制品中TEA 毒素均有檢出，AOH 毒素僅在紫晶棗中有檢出，ALT 毒素在香酥脆棗中的含量相對較高。就毒素種類而言，紫晶棗中檢出的鏈格孢毒素種類最多，其次是凍干棗片和香酥脆棗，在紅棗酒和紅棗提取物中的種類最少。就產品品項而言，紅棗酒受TeA 毒素污染最嚴重，其次是紅棗提取物。所有紅棗制品均未受到AME 和TEN的污染，這與原料紅棗中的毒素分布情況一致。

表7 紅棗制品中鏈格孢毒素含量Table 7 Content of Alternaria toxin in jujube products

3 結論

本研究以QuEChERS 為核心，結合固相萃取法建立了紅棗及其制品中鏈格孢毒素的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。分別采用QuEChERS 方法和固相萃取法提取固體、液體紅棗樣品中鏈格孢毒素；經超高效液相色譜-串聯質譜檢測，保留時間定性，外標法定量；5 種鏈格孢毒素在2.5～10 μg/kg 標準添加量下回收率均在68.35%～99.83%，相對標準偏差小于10%。該方法操作便捷、準確度高、靈敏性好，能夠滿足紅棗及其制品中鏈格孢毒素的測定要求。應用該方法對阿克蘇、喀什、和田三個地區原料駿棗和市售11 種紅棗制品中的鏈格孢毒素進行污染分析。三個地區的原料駿棗中共檢出TeA、AOH 2 種毒素，喀什地區原料駿棗中的TeA 含量最高，為5.12～10.76 μg/kg。11 種紅棗制品中共檢出TeA、AOH、ALT 3 種毒素，紅棗酒中的TeA 含量最高，達到127.08 μg/kg，紫晶棗中檢出AOH，含量在34.76～98.61 μg/kg；凍干棗片、香酥脆棗和紫晶棗中檢出ALT，含量在2.04～399.64 μg/kg。為紅棗采后貯藏及紅棗加工制品中鏈格孢毒素的污染防治和管理措施制定提供技術支持，為紅棗及其制品的食用安全性評價提供理論依據和參考。