碳量子點酒對幽門螺旋桿菌藥效學研究及作用機制預測

張喜武，胡志欣，王雅泓，竇金金

（1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱成程生命與物質研究所，黑龍江哈爾濱 150500；3.黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院，黑龍江哈爾濱 150040）

幽門螺旋桿菌（，Hp）是一類對生存環境較為苛刻的革蘭陰性細菌，菌株整體以螺旋狀存在，其作為一種流行的致病細菌，常在胃部匯集并復制感染。作為I 類致癌物，全球感染Hp的人口已占半數之多，有些國家甚至有90%的人口曾感染過此類細菌。Hp 在胃內定植主要依靠此類細菌獨特的酸適應機制，治療不及時常會誘發消化性潰瘍、胃腺癌等疾病，甚至與心血管、神經、肝膽等系統疾病也息息相關。現如今臨床上最常使用的治療方法即抗生素三聯療法，然而隨著耐藥菌株的出現其治療效果不盡人意，常常無法根治甚至出現反復感染的現象，且由于使用抗生素產生的不良反應導致患者耐受性下降，對機體損害較大。因此，尋找治療及預防幽門螺桿菌感染的新方法具有必要性。

酒是中醫藥科學重要組成部分，其發展史源遠流長，《本草求真》記載：“酒能升陽發散，若引經用為向導，則其勢最速，辛則通身達表，引入至高顛頂”，祖國醫學常用酒配藥治療各種疾病。女性更年期綜合征如今呈現發病早、發病率高的趨勢，常伴焦慮、抑郁和睡眠障礙等癥狀，本研究者基于此研發了一款女士酒，主要成分為丁香、木瓜等8 味中藥，現已授權發明專利（ZL201910659190.0），其中丁香具有消炎抑菌及抗腫瘤護肝的作用，木瓜具有抗胃潰瘍、修護腸損傷、以及保肝抗炎加強機體免疫的功效。酒中有效成分為所添加8 味藥食同源中藥的醇溶性成分，因此同時具有藥食兩用性，近年來常以食補、藥膳等形式應用于醫療保健。碳量子點采用超音速對撞粉碎及光電碳化技術制備碳量子點溶膠，為一種新興納米給藥技術，并采用科學吸附技術，將原酒中的氰化物、重金屬等有害物質清除，將影響口感的雜醇、雜質有效吸附，再通過高頻脈沖設備將酒中對人體有益物質高度活化，女士酒和堿性白酒均采用此技術制備而成，不僅具有更好的吸收效果，還兼備了低毒性、生物相容性等優點。酒精是性質良好的有機溶劑，可使中藥中的有效成分更大程度溶出，近年來多有研究表明，適量、規律飲酒不僅對機體無損傷，而且對一些疾病甚至具有預防及治療作用。此外，在對服用女士酒、堿性酒的跟蹤調查中意外發現，感染幽門螺旋桿菌的人群中出現了不同程度的好轉甚至痊愈。基于此，本實驗針對女士酒、堿性酒對Hp 的抑制作用進行研究，探討其對Hp 感染小鼠胃部病態變化的影響，并結合網絡藥理學，通過各數據平臺檢索篩選，對白酒中有效成分抑制Hp 作用靶點及相關通路進行分析預測，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級KM 小鼠 70 只，18～22 g，雌雄各半，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號（SCXK（黑）2018-003）；碳量子點女士酒（主要配方：每1 L 原酒中含丁香、木瓜、桑葚、天門冬及大棗各5 g，含熟地黃、刺五加、枸杞各2.5 g，加入冰糖將酒精度調至35°，含糖量50 g/L）、碳量子點堿性白酒（pH＞7，酒精度58°） 黑龍江沃生生命波團簇酒業有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養基、圓底立式厭氧培養袋、2.5 L 微需氧產氣包 青島海博生物；幽門螺旋桿菌試紙 廣州貝思奇診斷試劑有限公司；幽門螺桿菌國際標準菌株（ATCC 43504） 上海北諾生物科技有限公司。

37 ℃恒溫培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 本實驗中包含的動物試驗均符合相關國家標準，實驗過程中嚴格遵守本校實驗動物倫理委員會所制定的動物倫理學規范，相關操作均得到委員會批準。將實驗小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性藥物組（抗生素三聯：甲硝唑14.2 mg/kg+克拉霉素7.15 mg/kg+奧美拉唑400 nmol/kg）、女士酒高劑量組（49.4 mL/kg）、低劑量組（24.7 mL/kg）及堿性酒高劑量（49.4 mL/kg）、堿性酒低劑量組（24.7 mL/kg），10 只小鼠為一組，共7 組。各給藥組給藥劑量參照人類臨床常用劑量并結合相關文獻設計定量，并依據人與動物體表面積計算法換算得到各組小鼠灌胃劑量。每天定量給予實驗小鼠專用鼠糧，自由飲水，保持環境溫度濕度恒定，飼養7 d 以適應周圍環境，之后開始造模。按

1.2.2 項下步驟進行模型復制，造模結束后，將各組對應藥物配制成相應濃度，均以每日0.2 mL/10 g 灌胃，空白組及模型組給予等量生理鹽水，連續給藥20 d。藥物干預期間各組小鼠保持飼養條件一致，正常攝食飲水。

1.2.2 模型復制及評價

1.2.2.1 ATCC 43504 細菌培養 在超凈工作臺上吸取100 μL 復蘇后的Hp 菌懸液，接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，待培菌液吸干倒置放入含有微需氧產氣包的厭氧培養袋中，密封后置于37 ℃恒溫培養箱中。待細菌長滿平板，如圖1a，用接種環輕輕挑取菌落，涂于Hp 試紙上，試紙顏色由黃變紫。用生理鹽水洗下菌落，于600 nm 條件下測量菌液OD 值，并調節濃度至1×10CFU/mL，收集于試管中，上下翻倒輕輕搖勻后立即灌胃。

1.2.2.2 模型復制 采用上述留存的ATCC 43504菌懸液，濃度為1×10CFU/mL。造模前禁食24 h，除空白對照組，其余組小鼠均先用5%碳酸氫鈉灌胃0.2 mL/只，30 min 再灌胃Hp 菌液0.2 mL/只，而后繼續禁食禁水3 h，之后恢復正常飼養。隔天感染一次，共8 次。空白對照組給以等量生理鹽水。

1.2.2.3 模型評價 末次灌胃菌液2 h 后采用脫頸法處死小鼠，所有操作均按照動物倫理學規定進行，快速完整取胃，觀察胃部形態變化。沿胃大彎剖開胃，清理干凈后小心刮取胃黏膜組織進行尿素酶試紙檢測。造模成功后按上述給藥方式分組給藥。

1.2.3 藥效檢測指標及方法

1.2.3.1 一般體征觀察 各組小鼠在實驗期間均定量給食，自由飲水，密切觀察實驗動物一般情況，如靈活程度、精神狀況、毛發狀態、情緒變化及進食進水情況，定期稱量體重。

1.2.3.2 胃部大體形態學觀察 末次給藥后將小鼠脫頸處死，沿腹部剖開，剝離其他組織，完整取出小鼠全胃。用生理鹽水清洗胃標本，然后用吸水紙輕輕吸干，觀察胃部大體形態學變化。

1.2.3.3 胃竇部粘膜組織尿素酶檢測 將小鼠胃組織沿胃大彎剪開，除去胃中殘留食物等雜質，用生理鹽水清洗干凈后輕輕刮取胃竇部粘膜組織，用Hp 試紙進行尿素酶檢測，按以下標準記錄結果：強陽性：試紙 1 min 內變紅；弱陽性：試紙3 min 內變紅；陰性：試紙不變色。

1.2.3.4 胃組織病理學HE 染色 將小鼠胃部剖開平展，放入裝滿生理鹽水的燒杯中，反復涮洗至附著的血漬及雜質全部去除，然后浸泡于4%多聚甲醛溶液中，使用不同濃度的乙醇沖洗以去除組織中的水分，之后使用石蠟將組織包裹，按需切成一定厚度的薄片，染色后倍鏡下觀察，分析小鼠胃黏膜處是否出現炎癥及胃部微觀病理變化。

1.2.3.5 肝組織病理學HE 染色 取胃后繼續分離出肝臟，按1.2.3.4 所示步驟染色處理，觀察肝組織變化。

1.2.4 碳量子酒對Hp 抑制作用的網絡藥理學研究

1.2.4.1 白酒微量化學成分收集及靶點預測 查閱白酒相關文獻，對其中主要健康成分進行初步篩選。然后在化源網及Pub Chem 網站對其進行檢索，采集2D 結構的sdf.文件，并通過SwissADME 對化學成分進行性質篩選，選取并記錄“GI absorption”值為High 且“Druglikeness”項下不少于三個Yes 的成分。借助TCMSP 數據平臺檢索化學成分的潛在作用靶點，通過UniProt 數據庫得到物種分類為“Human”且已證實的與作用靶點對應的基因名。

1.2.4.2 疾病相關靶點預測收集 以“H.pylori”為關鍵詞，物種設置為“Homo sapiens”，在GeneCards 數據庫進行疾病靶點的搜索預測。

1.2.4.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建 將收集的酒中健康成分相關靶點與篩選到的疾病相關靶點導入Draw Venny Diagram 獲取交集。通過cytoscape 3.7.1 對交集靶點分析并構建蛋白互作網絡圖，利用“Network analysis”插件對數據進行處理，獲取核心靶點。

1.2.4.4 GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集 借助生信自學網對＜0.05 的交集靶點進行GO 及KEGG通路富集分析，其中GO 分析包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）三個部分。

1.2.4.5 靶點-信號通路網絡構建 將1.2.4.4 項下通過KEGG 富集分析得到的排名前20 的通路進一步篩選，去除其中有關癌癥、病毒的信息，得到與疾病關聯緊密的通路。而后將各通路及通路上富集的靶點制成network 文件上傳至cytoscpe 3.7.1，繪制出靶點-信號通路網絡圖。

1.3 數據處理

統計學分析采用SPSS 26.0 軟件進行。數據以平均值±標準差（x ˉ±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，其中＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 模型評價結果

結果如圖1 所示，模型小鼠尿素酶試紙于1 min內由黃變紫，結果呈陽性，如圖1b；空白組小鼠試紙檢測未變色呈陰性，如圖1c。空白小鼠胃部紅潤光澤，整體完整無變形，如圖1d；而模型組小鼠見圖1e，外部暗紅發紫，表面出現很多黑色凸起，整體皺縮，病變明顯。將胃沿胃大彎展開后，模型組與空白組胃部對比如圖1f，可見模型組組織上出現點星狀出血。綜上所述，可判斷模型復制成功。

圖1 模型評價結果Fig.1 Results of model evaluation

2.2 藥效學評價結果

2.2.1 一般體征觀察及體重變化曲線 實驗期間，空白組小鼠精神情況良好，日常活潑好動，飲食積極；模型組小鼠整體狀態逐漸轉差，較呆滯，抓取時易受驚嚇，掉毛嚴重，小鼠體質量在后期增加緩慢，與其他組差異逐漸明顯；給藥組與模型組相比，整體狀態逐漸恢復，鼠毛由粗糙干燥逐漸恢復干凈順滑，攝入排泄均正常。

體重變化見表1，實驗前期由于灌胃反復抓取導致所有組別小鼠體重均有所下降，適應后恢復正常。相比于空白組，模型組小鼠體重增長緩慢，實驗后期兩組間差距明顯；與模型組相比，給藥組小鼠體重在實驗后期恢復正常，穩定增長。其中女士酒高、低劑量組相比于堿性酒組體重增長幅度小，這可能與女士酒中添加的中藥成分具有改善腸道菌群，促進消化的功效有關。

表1 小鼠體重變化Table 1 Body weight changes of mice

2.2.2 胃部大體形態學觀察 結果如圖2 所示，空白組小鼠胃部顏色紅潤，外部平整；模型組小鼠胃部呈現暗紫色，表面凹凸皺縮，出現明顯病變，并可見表面存在點星狀充血；抗生素三聯治療組小鼠胃部顏色淡紅，外部平展，與空白組較為接近；供試藥組上述情況均出現明顯好轉，且女士酒、堿性酒高劑量組相比低劑量組效果更佳。

圖2 酒對幽門螺桿菌感染小鼠胃部大體形態影響Fig.2 Influence of alcohol on the general morphology of stomach in mice infected by Hp

2.2.3 女士酒、堿性酒對Hp 感染小鼠胃竇部粘膜組織尿素酶的影響 由表2 可知，與空白組相比，模型組尿素酶檢測強陽性率及總陽性率均顯著升高（＜0.05），可判斷小鼠感染模型復制成功；給予抗生素三聯、女士酒及堿性酒灌胃治療后，陽性對照組、女士酒高、低劑量組及堿性酒高劑量組強陽性率、總陽性率均極顯著降低（＜0.01），說明女士酒及堿性酒對Hp 在胃竇部的定植、生長存在抑制作用，且女士酒抑制作用較強，女士酒高劑量組作用效果與抗生素三聯組較相近；各給藥組抑菌能力呈現劑量依賴性。

表2 酒對Hp 感染小鼠胃竇部粘膜組織尿素酶的影響Table 2 Effect of alcohol on the urease of gastric antrum mucosa in mice infected by Hp

2.2.4 胃組織標本HE 染色 如圖3 所示，空白組小鼠胃黏膜處細胞分布均勻，規則排列，未見炎癥、損壞等病變；模型組胃標本切片明顯可見胃腺細胞缺失，排列凌亂，出現大量炎性細胞浸潤現象；給藥后上述情況出現好轉，女士酒、堿性酒低劑量組炎性細胞明顯減少，炎癥程度明顯降低；女士酒、堿性酒高劑量組幾乎不可見炎癥反應，胃腺細胞分布較清晰工整；與陽性對照組及空白組切片情況較為接近。

圖3 酒對Hp 感染小鼠胃組織標本影響（HE 染色，200×）Fig.3 Influence of alcohol on gastric tissue specimens of mice infected by Hp (HE staining,200×)

2.2.5 肝組織標本HE 染色 如圖4 所示，各組之間切片差異較小，并未產生病理性病變，細胞整體均勻緊湊，細胞核完整，無腫脹壞死，模型組泛紅充血處有少量炎性細胞，其余各組未見炎癥發生，說明此飲用量對肝臟無損傷。圖4b、圖4d 左上角泛紅充血為取材導致的血管淤血，圖4e 顏色較淺為切片較薄所致。

圖4 肝組織標本（HE 染色400×）Fig.4 Liver tissue specimen (HE staining 400×)

2.3 碳量子酒對Hp 抑制作用的網絡藥理學研究

2.3.1 白酒微量化學成分靶點預測 如表3，通過文獻查閱及篩選共得到21 個滿足要求的所需化學成分。將化學成分及對應靶點蛋白名導入cytoscape 3.7.1 中繪制化學成分-靶點作用網絡圖，圖中共有個330 節點、546 條邊，詳見圖5。

圖5 白酒化學成分-靶點作用網絡圖Fig.5 Liquor chemical composition-target interaction network diagram

表3 白酒中化學成分對應靶點Table 3 Corresponding targets of chemical components in liquor

2.3.2 Hp 關聯靶點預測 在1.2.4.2 所述數據庫中共得到1789 個疾病靶點，根據“Relevance score”值計算中位數，去除小于中位數的靶點，最后得到疾病相關靶點905 個。

2.3.3 PPI 網絡的構建 通過Draw Venny Diagram得到74 個成分-疾病交集靶點，如圖6 所示，其中藍色代表成分靶點，粉色代表疾病靶點，中間交集即共有靶點。利用cytoscape 3.7.1 對交集靶點分析并構建蛋白互作網絡圖，通過“Network analysis”插件對數據進行處理，得到蛋白靶點各參數，分別計算“Degree”、“Betweenness”、“Closeness”、“LAC”和“NeighborhoodConnectivity”值的中位數，舍棄小于中位數的靶點，最后得到HNRNPU、HNRNPA1、U2AF2、CUL4B、ACTB、PARP1、NEDD8 等53 個核心靶點，該網絡包括151 個節點，1060 條邊，如圖7所示。

圖6 交集靶點韋恩圖Fig.6 Wayne diagram of common target

圖7 PPI 網絡圖Fig.7 PPI network diagram

2.3.4 GO 及KEGG 富集分析 選取KEGG 分析排名前20 且＜0.05 的通路途經，繪制氣泡圖，如圖8。此外，對生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）進行GO 分析，選取排名前15 且＜0.05 的功能信息作圖。

圖8 KEGG 和GO 富集分析氣泡圖Fig.8 Enrichment analysis of key KEGG and GO pathways

2.3.5 靶點-信號通路網絡構建 篩選結束最終得到8 條與Hp 疾病相關聯的通路，分別為IL-17 信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、細胞凋亡、TNF 信號通、致病性大腸桿菌感染、MAPK 信號通路、T 細胞受體信號通路以及PI3K-Akt 信號通路。然后采集通路上富集的靶點，根據所需制成network 文件，通過cytoscape 3.7.1 繪制出靶點-信號通路網絡圖（圖9）。

圖9 靶點-信號通路網絡圖Fig.9 Target-signal pathway network diagram

3 討論與結論

根據國家保健食品相關標準規定，女士酒、堿性酒作為補養型保健酒類產品，通過調節人體機能，進而發揮增強人體免疫力，調節腸道菌群及對胃黏膜損傷有輔助保護功能，日常均可合理飲用，酒中含有的微量成分，不僅對白酒的口感及質量有不同程度的影響，還可促進機體循環、緩解疲乏，舒緩身心。由藥效實驗結果可知，合理飲酒可阻礙Hp 在體內的定植及增殖，發揮抑菌作用，其中女士酒作用更強，這主要是因為女士酒中含有木瓜、丁香等8 味中藥，酒-藥相互協作，增強了抑菌效果。中醫認為，幽門螺桿菌感染屬于陽明胃熱類疾病，而丁香、木瓜具有溫中降逆、和胃化濕之功效且均有較好的抗炎殺菌功能。已有研究表明，丁香揮發油中的主要成分丁香酚可與Hp 通過特定方式結合，從而影響其活性，達到理想抑菌作用；并且在體外抑制幽門螺桿菌實驗中丁香醇提物也顯現出了更強的抑制作用。覃慧林等發現木瓜乙酸乙酯萃取部位對急性胃潰瘍引起的胃粘膜損傷具有保護作用，此外，亦有實驗證實木瓜總三萜可抑制機體炎癥小體信號通路，進而對Hp 引起的胃炎發揮抑制作用。本研究通過建立Hp 小鼠感染模型，證實了女士酒、堿性酒能夠影響Hp 在小鼠體內的定植及活性，提高了對胃黏膜處Hp 的清除率且呈現劑量依賴性，同時能夠減輕胃竇部由于細菌感染引起的炎癥。根據肝臟病理切片可知此給藥量對肝臟不會造成損傷，且酒中所含有效成分具有低毒性、低耐藥性的優點，因此女士酒、堿性酒在抑制幽門螺旋桿菌方面具有廣大的研究及應用前景。

此外，通過網絡藥理學進一步探究了堿性酒、女士酒抑制幽門螺桿菌的作用機制。查閱白酒相關文獻收集白酒中含有的微量健康成分，主要包含萜烯類化合物：-石竹烯、香葉基丙酮等；芳香族類化合物：香蘭素、4-甲基愈創木酚、阿魏酸等；吡嗪類化合物：四甲基吡嗪等諸多化學成分。根據PPI 網絡分析，篩選得到度值排名靠前的潛在靶點，最終得到CUL4B、ACTB、PARP1、U2AF2 等53 個核心靶點，CUL4B是一類與胃部疾病關聯密切的骨架蛋白，在胃癌、食管癌中均存在高度表達，通過調控Wnt/-catenin 信號通路影響細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化過程。PARP1、U2AF2 及ACTB 影響機體炎癥因子的表達，且ACTB 在炎癥性腸病中的表達與炎癥、血管新生程度正向相關。所得到的核心蛋白總體上與機體炎癥、細胞增殖、血管、癌癥及凋亡等有關，以往研究顯示，Hp 定植于胃部后，常先引起局部炎癥，繼而產生病變擴散，最終惡化至胃癌等各種惡性疾病。因此，白酒中的健康成分極有可能通過影響這些蛋白靶點從而抑制Hp 的定植生存，發揮抑制作用。

GO 分析中主要涉及對細菌來源分子的反應、對細菌的反應、凋亡信號通路的負調控以及防御反應的調節等BP 過程，溶酶體、膜筏、細胞外基質等CC 過程，氧化還原酶活性、血紅素結合、裂解酶活性等MF 過程，進一步表明了這些微量成分與抑菌、抗炎等生物過程有著緊密聯系。KEGG 通路富集分析結果顯示，抑制Hp 主要通過調控IL-17 信號通路、TNF 信號通路、致病性大腸桿菌感染、MAPK 信號通路及PI3K-Akt 信號通路等發揮作用。IL-17、TNF 是常見的炎癥因子，其在胃癌組織中過度表達并能促進胃癌細胞的增殖、遷移，加重炎癥在體內的擴張，如今臨床中常將IL-17、TNF 體內水平作為評價Hp 感染程度及所導致的慢性胃炎炎癥程度的評價指標。MAPK 信號通路對炎癥、應激、凋亡、細胞生長和分化等諸多重要生理過程發揮調節作用，羅強等實驗證實，酒中含有的吡嗪類物質發揮作用于MAPK 通路從而降低HpM 誘導的炎癥因子分泌，進而抑制由Hp 代謝物誘導的炎癥。綜上所述，白酒中微量健康因子主要通過調控多條通路作用于多個靶點，控制炎癥因子的產生及傳遞，最終達到抑制幽門螺桿菌的作用，可為日后研究提供參考。