藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝、腎損傷的改善作用

黨 婭 ，尤 麗 ，楊彬彥

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000；2.陜西省果業管理局秦巴山區藍莓研究所，陜西漢中 723000；3.陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種代謝性疾病，是由于胰島素產生不足導致空腹血糖水平升高，已在全球范圍內流行。全球4.1 億糖尿病患者及3.18 億存在患糖尿病風險的人群中，中國占三分之一以上，其中2 型糖尿病的發病率約為90%。2 型糖尿病患者發病機理復雜，主要特征是血糖水平升高，機體長期處于高血糖狀態不僅會導致糖脂代謝的異常、炎癥反應、氧化應激等病理變化，還會導致眼、腎、肝臟等組織器官并發癥的產生，無法行使正常的代謝功能，嚴重時可導致器官衰竭甚至死亡。糖尿病腎病是糖尿病最主要的并發癥，約占糖尿病患者的40%，具有動脈粥樣硬化的風險。糖尿病肝病是繼發于糖尿病導致的肝臟結構與功能損傷的一種慢性并發癥，肝臟的損傷又使機體糖脂代謝紊亂，糖尿病病情進一步加重。因此，保護肝腎的正常功能，對控制糖尿病的發生與發展具有重要意義。

治療糖尿病的兩種傳統方法是注射胰島素和口服降糖藥。這些藥物雖能改善2 型糖尿病患者的健康狀況，但會產生低血糖、心腦血管疾病、胃腸道疾病等副作用，對糖尿病并發癥的治療效果甚微。近年來，許多國內外研究學者發現，許多日常消費的食品，如各種水果蔬菜中的天然活性物質，都表現出良好的緩解糖尿病并發癥的作用。因此，利用飲食治療2 型糖尿病已經成為一種新策略。研究發現，植物中的花青素具有良好的降糖作用，與機體抗氧化活性的加強、脂質過氧化損傷的降低密切相關，如黑米花青素、葡萄籽花青素等。因此，在抑制氧化應激誘導的損傷方面具有優異抗氧化活性的天然活性物質成為降低糖尿病風險的最佳治療策略。

藍莓含有豐富的營養成分，如蛋白質、脂肪、碳水化合物、花青素、尼克酸等，其中花青素含量高達387～487 mg/100 g，具有較高的營養價值。藍莓花青素是從藍莓中提取的一種類黃酮天然色素，是迄今為止最高效的抗氧化劑之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制腫瘤細胞生長、調節腸道菌群等功能作用。Si 等的研究發現，含有花青素的飲食可有效控制食物攝入量和肝臟重量，并顯著降低肥胖觸發的胰島素抵抗，還能有效地改善脂肪變性和細胞腫大。但目前在藍莓花青素修復肝臟、腎臟損傷方面的研究較少，仍需深入研究。因此，本試驗采用鏈脲佐菌素聯合高脂、高糖飼料誘導2 型糖尿病小鼠模型，探討藍莓花青素對糖尿病小鼠臟器組織損傷的修復作用，為藍莓花青素在功能食品的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性昆明小鼠 65 只，體重20～25 g，動物許可證號SCXK（陜）2020-001，西安恩斯維爾生物科技有限公司。普通飼料、高脂飼料 成都達碩試驗動物有限公司（許可證號SCXK（川）2019-031）。普通飼料配方：玉米73.5%，麥麩20%，魚粉5%，谷粉1%，食鹽0.5%；高脂飼料配方：普通飼料66.5%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1%，豬油10%。所有試驗動物均飼養于24±2 ℃的恒溫恒濕動物房內，自由飲食、飲水。

藍莓花青素（純度40.1%） 楊凌萃健生物工程技術有限公司（CP190914）；鹽酸二甲雙胍片 上海普康藥業股份有限公司；鏈脲佐菌素 美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖 分析純，天津市盛奧化學試劑股份有限公司；生理鹽水、4%多聚甲醛組織固定液 廣州賽國生物科技有限公司；PBS 磷酸鹽緩沖液 上海源葉生物科技有限公司；蘇木素、伊紅 武漢賽維爾生物科技有限公司；中性樹膠北京索萊寶科技有限公司；高效切片石蠟 上海佩歐生物科技有限公司；谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒 江蘇晶美生物科技有限公司；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

高速冷凍離心機、微型離心機 湖南湘儀離心機有限公司；-20 ℃低溫冰箱、-80 ℃超低溫冰箱Panasonic/日本松下；自動高壓蒸汽滅菌器 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；電熱恒溫培養箱、真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；超純水系統 默克化工技術有限公司；移液器 德國Eppendorf；ZX-60XZX 上海知信雪花制冰機 上海知信實驗儀器技術有限公司；SpectraMax M3 全波長酶標儀 美國Molecular Devices 公司；紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；GA-3 型血糖試條、GA-3 型血糖儀、一次性使用末梢采血針 三諾生物傳感股份有限公司；高速勻漿器 天津恒奧科技發展有限公司；生物組織包埋機、RM2015 切片機、DM 500 光學顯微鏡 德國Leica。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立 取6 周齡，體重20～25 g 雄性昆明小鼠65 只適應性喂養1 周（（24±1）℃、12 h 晝/夜循環），使用正常飼料飼喂小鼠。觀察生長情況，自由飲食飲水。隨機抽樣的方法，將小鼠分正常組（基礎飼料飲食組10 只）、實驗組（高脂飼料飲食組55 只），喂養4 周。禁食不禁水8 h 后稱量小鼠體重，根據體重計算STZ 注射量。實驗組連續3 d 腹腔注射STZ 緩沖液（50 mg/kg），注射體積為0.5 mL/100 g，正常組注射同劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，造模期間自由攝食、飲水。待穩定72 h 后禁食不禁水8 h，用血糖儀以尾靜脈針刺的采血方法，測定小鼠的空腹血糖（FBG），選取空腹血糖值大于11.1 mmol/L 的小鼠進行實驗。

1.2.2 動物分組及給藥 將造模成功的小鼠隨機分為5 組，參考文獻等效劑量換算，分組及灌胃給藥情況如下：正常對照組8 只（Normal Control Group，NC）、模型對照組8 只（DM）灌胃等量生理鹽水；陽性藥物組8 只（Metformin，MET）灌胃250 mg/kg 鹽酸二甲雙胍溶液；藍莓花青素低劑量組（BA-L）、中劑量組（BA-M）和高劑量組（BA-H）分別灌胃100、200、300 mg/kg 藍莓花青素。灌胃時以0.1 mL/10 g為標準進行灌胃，每周根據每只小鼠的體重調整灌胃劑量，連續給藥4 周。灌胃4 周后，將小鼠禁食過夜，稱量體重，隨后進行眼眶取血，用10 mL 離心管收集小鼠血液1～2 mL，靜置4 h 后，用離心機4000 r/min離心15 min，取上層血清，分裝于-20 ℃冰箱保存，用于各項指標的測定。采血后，將所有小鼠脫臼處死。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 肝、腎臟器指數的測定 解剖小鼠，取出小鼠肝臟、腎臟組織，觀察組織情況。用生理鹽水沖洗后濾紙吸去水分后稱重，獲得臟器質量。肝臟、腎臟的臟器指數按如下公式計算。

1.2.3.2 肝、腎功能指標的測定 同1.2.2 取血清。根據試劑盒檢測說明書，采用酶標儀檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）活性，尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）含量。

1.2.3.3 肝、腎組織抗氧化指標測定 將處理后的肝臟、腎臟放入-80 ℃冰箱，用于相關指標的測定。測定時從-80 ℃冰箱將小鼠肝、腎組織取出，與0.9%生理鹽水按照1:9 的比例混合，制成10%組織勻漿液，離心機4000 r/min 離心10 min，取組織勻漿上清液，待用。分別取肝腎組織的勻漿上清液測定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA），測定過程嚴格按照試劑盒檢測說明書進行操作。

1.2.3.4 肝、腎組織病理學觀察 將處理好的肝臟、腎臟在4%多聚甲醛中固定24 h 后取出，用低濃度到高濃度的酒精進行梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、常規石蠟包埋、組織切片、脫蠟、HE 染色，封片后于光學顯微鏡下觀察肝細胞、腎細胞的形態、組織結構等病理學變化。

1.3 數據處理

采用SPSS 25.0 軟件對實驗數據進行統計分析，所有數據均表示為平均值±標準差（x ˉ±s）。用Graph-Pad Prism 8.0 軟件進行圖片繪制。進行單因素方差分析（ANOVA）、檢驗或Sidak 的多重比較檢驗以確定不同組之間的統計差異。在＜0.05 時表示差異顯著，＜0.01 時表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝、腎臟器指數的影響

機體的正常生理活動與組織器官息息相關，各組織器官的重量也與相關疾病相關聯。正常狀態下，小鼠的臟器指數較穩定，一旦組織受到損傷，臟器指數也會隨之變化。長期的高脂飲食將會使體內激素分泌紊亂，致使肝臟、腎臟負擔加重，進而導致肝腎損傷或者腫大等現象的發生，同時2 型糖尿病引起的炎癥反應也會致使臟器指數上升。因此，通過臟器指數可以幫助了解組織器官的健康狀態。

模型組小鼠的肝臟、腎臟組織與正常組相比明顯腫大。由圖1 可得出，模型組小鼠臟器指數極顯著增加（＜0.01），說明糖尿病小鼠肝腎組織存在一定損傷。灌胃四周后，與模型組相比，藍莓花青素低、中、高劑量組肝腎臟器指數均明顯下降，肝臟指數分別下降了7.30%、9.66%、15.38%，腎臟指數分別下降了7.19%、11.38%、16.17%，說明藍莓花青素可抑制糖尿病小鼠肝臟和腎臟的腫大，且在劑量范圍內，藍莓花青素的劑量濃度越大，抑制肝腎腫大的效果越好。

圖1 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠臟器指數的影響Fig.1 Effect of blueberry anthocyanin on viscera index in type 2 diabetic mice

2.2 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝功能、腎功能的影響

2.2.1 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟功能的影響 肝臟是機體代謝的主要場所和胰島素抵抗的重要靶器官。保護肝臟的正常功能對緩解機體胰島素抵抗、控制糖尿病的發展具有重要意義。評價肝臟損傷的標志物和肝細胞功能的指標主要有谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT），血清中ALT、AST 活性增加則意味著肝臟受到損傷。

由圖2 可知，模型組小鼠血清ALT、AST 活性與正常組相比極顯著升高（＜0.01），說明2 型糖尿病小鼠的肝細胞功能受到破壞。二甲雙胍和藍莓花青素干預后，與模型組相比，二甲雙胍組ALT、AST 活性均極顯著降低（＜0.01）；藍莓花青素低、中、高劑量組ALT 活性、AST 活性極顯著下降（＜0.01），ALT下降14.71%、25.25%、41.61%，AST 下降27.96%、36.13%、45.35%，說明藍莓花青素對兩個肝功能重要指標ALT、AST 有明顯改善作用，進而表明藍莓花青素對STZ 引起的肝損傷具有潛在的保護作用。

圖2 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟功能的影響Fig.2 Effects of blueberry anthocyanins on liver function in type 2 diabetic mice

2.2.2 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠腎臟功能的影響 肌酐在體內進行代謝分解，其產物主要就是血肌酐（Scr），蛋白質在體內進行分解代謝后的終端產物即為尿素氮（BUN）。糖尿病腎病的臨床表現之一就是血清中血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量升高，當Scr 和BUN 含量明顯高于正常值時，腎功能受到嚴重損害。因此，Scr 和BUN 可作為檢測腎功能變化的重要指標。

由圖3 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清血肌酐和尿素氮含量極顯著上升（＜0.01），說明模型組小鼠腎功能可能出現破壞。經藍莓花青素灌胃4 周后，藍莓花青素低、中、高劑量組小鼠Scr 與模型組相比均存在下降趨勢（＜0.05），且隨著藍莓花青素濃度的增加，下降幅度越大；藍莓花青素低、中、高劑量組BUN 含量分別下降10.8%、18.98%、31.27%，高劑量組BUN 下降趨勢最為顯著（＜0.01），表明藍莓花青素在保護腎功能上有一定的功效。

圖3 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠腎臟功能的影響Fig.3 Effects of blueberry anthocyanins on kidney function in type 2 diabetic mice

2.3 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟、腎臟抗氧化能力的影響

2.3.1 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟抗氧化能力的影響 器官損傷通常是由氧化應激引起的，氧化應激是指機體內自由基的產生與清除失衡時，產成過量的自由基而導致細胞壞死、組織損傷、能量代謝異常等不良反應。肝臟在代謝時易產生大量的自由基，這可能會導致脂質過氧化、抗氧化酶的消耗和胰島素抵抗，甚至更嚴重的組織損傷。因此，改善機體肝臟組織的氧化應激狀態，對改善肝功能、修復肝損傷、減少脂質的過氧化進而改善糖尿病并發癥具有重要意義。

圖4 顯示了各組小鼠肝臟組織MDA 含量與SOD、GSH-Px 活性。由圖4（a）可知，STZ 誘導的糖尿病小鼠肝臟MDA 含量與正常組小鼠相比極顯著上升（＜0.01），表明糖尿病小鼠肝臟發生氧化損傷。同時，藍莓花青素的干預一定程度上降低了MDA 的含量，說明藍莓花青素可改善糖尿病小鼠的氧化損傷，保護肝臟功能。為更進一步探究藍莓花青素減緩肝臟氧化損傷的機制，試驗還評價了藍莓花青素對肝臟抗氧化酶系的影響。如圖4（b）、4（c）所示，模型組小鼠肝臟SOD 和GSH-Px 活性極顯著低于正常組（＜0.01）。經不同劑量的藍莓花青素處理可顯著增強抗氧化酶的活性。高劑量組小鼠肝臟的SOD 和GSH-Px 活性最強，比模型組高25.22%、20.03%（＜0.01）；低劑量組也比模型組高17.07%、8.48%（＜0.05）。綜合分析可知，藍莓花青素可通過提高SOD、GSH-Px 活性來減緩肝臟的氧化應激作用，從而降低脂質過氧化程度，修復肝臟損傷。

圖4 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of blueberry anthocyanins on liver antioxidant capacity of type 2 diabetic mice

2.3.2 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力的影響 丙二醛（MDA）是自由基氧化反應的終產物，也是脂質過氧化損傷的重要標志，一定程度上反映了糖尿病的機理。圖5（a）顯示，模型組小鼠腎臟MDA 含量與正常組相比極顯著升高（＜0.01），說明模型組小鼠存在脂質過氧化現象。灌胃給藥四周后，與模型組相比，藍莓花青素低、中、高劑量組MDA 水平分別下降11.29%、22.98%、30.65%，說明藍莓花青素能夠減少小鼠腎組織中MDA 含量，減緩脂質過氧化程度，且隨著濃度的增高，效果愈加明顯。

圖5 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of blueberry anthocyanins on kidney antioxidant capacity of type 2 diabetic mice

機體內主要的抗氧化酶有SOD 和GSH-Px。SOD 是機體唯一能淬滅自由基的酶，可直接使超氧陰離子分解成水和氧，阻礙脂質過氧化的產生，減少機體損傷；GSH-Px 能使過氧化物轉化成羥基化合物，阻止過氧化物對細胞膜功能及結構的損害。由圖5（b）和圖5（c）可知，造模成功后，模型組小鼠腎組織SOD、GSH-Px 的活性與正常組相比極顯著下降49.82%和34.66%（＜0.01）。藍莓花青素治療后，各給藥組小鼠SOD、GSH-Px 活性與模型組相比均有所上升，其中高劑量組SOD 活性升高34.23%、GSH-Px活性升高25.62%（＜0.01），說明藍莓花青素能改變糖尿病小鼠腎組織SOD 和GSH-Px 活性降低的現象，對腎臟中的氧化應激表現出較強的抑制作用。

2.4 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝腎組織的影響

2.4.1 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟組織的影響 通過HE 染色觀察藍莓花青素對糖尿病小鼠肝臟組織形態的影響。圖6 呈現了灌胃4 周后，不同組小鼠肝細胞形態和結構的差異。由圖可知，正常組小鼠肝細胞是以中央靜脈為中心向四周排列的，細胞結構清晰完整，間隙正常，邊界分明，細胞核形態正常，肝細胞無明顯病變。與正常組相比，模型組小鼠肝細胞中央靜脈結構混亂不完整，胞漿內出現大量脂肪空泡，出現淤血現象，肝索和肝竇排列不規則，細胞核大小不一，細胞與細胞之間界限不清，說明STZ 誘導的糖尿病小鼠產生了嚴重的肝臟損傷。顯微鏡觀察顯示，通過藍莓花青素的干預可明顯改善糖尿病小鼠肝臟的脂肪空泡性、肝細胞的結構，同時使組織中肝細胞數目增加。高劑量藍莓花青素的干預對糖尿病小鼠肝組織損傷修復最好，改善效果最為明顯。結合肝功能的測定結果綜合分析，藍莓花青素具有改善肝組織細胞形態，修復肝細胞損傷的作用，且高劑量的藍莓花青素顯示更佳的修復作用。

圖6 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠肝臟組織的影響Fig.6 Effects of blueberry anthocyanin on liver tissue of type 2 diabetic mice

2.4.2 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠腎臟組織的影響 為了更直觀地觀察糖尿病小鼠腎臟的組織損傷情況，給藥4 周后，將各組小鼠的腎臟進行組織病理學切片并染色，如圖7 所示。正常組小鼠腎臟組織結構清晰，細胞分布均勻、排列正常，腎小球基底膜未見異常，腎小囊體積、囊腔間隙正常。與正常組相比，模型組小鼠腎臟結構不清晰，腎小球內部細胞增多、體積變大且界限不明，腎小囊囊腔間隙變小，基底膜增厚且系膜基質增生，還伴有炎性細胞的侵潤。說明糖尿病小鼠的腎臟組織發生了嚴重的損傷。經藍莓花青素治療后，各劑量組小鼠腎臟的病變情況均有所改善，其中高劑量組改善效果更為明顯，腎小球、腎小管形狀有所緩解，結構較為規則清晰，基底膜恢復正常，囊腔間隙縮小，炎性細胞浸潤情況稍有改善。

圖7 藍莓花青素對2 型糖尿病小鼠腎臟組織的影響Fig.7 Effect of blueberry anthocyanin on renal tissue of type 2 diabetic mice

3 討論與結論

常見的糖尿病并發癥有糖尿病肝病和糖尿病腎病。糖尿病肝病主要特征為肝內脂肪滴增多、肝糖原沉積、肝細胞水腫且出現脂肪空泡等。糖尿病腎病的主要特征是腎小球肥大、腎小球和腎小管結構和功能發生改變、腎臟纖維化等。前期研究了藍莓花青素對糖尿病小鼠的降糖降脂作用，結果顯示良好，且糖尿病會引發肝腎損傷，因此，在降血糖、降血脂的基礎上研究藍莓花青素對肝腎損傷的修復作用具有重要意義。

組織器官損傷與糖尿病密切相關。本研究中，在高脂、高糖的飼養條件下，小鼠出現肝、腎臟器官腫脹。經過4 周干預后，藍莓花青素組糖尿病小鼠肝臟、腎臟指數顯著降低，肝組織形態、肝索和肝竇排列顯著改善，腎臟的腫大和損傷、腎小球、腎小管組織狀態、囊腔腔隙等得到明顯改善，說明藍莓花青素能夠修復高血糖導致的肝臟、腎臟的組織損傷。Lee 等研究發現富含花青素的凍干藍莓粉能有效地控制高脂膳食小鼠的肝臟重量和功能損傷，這與本研究結果一致。

血液與動物體內的大部分組織直接接觸，病理變化很可能反映在血液樣本中某些蛋白質和酶的水平上。血清中ALT 和AST 的增強已在臨床上用作肝損傷生化標志物，BUN 和Scr 也在臨床上被廣泛用于反映腎臟的狀況。在本研究中，ALT 和AST 活性的變化以及血清BUN 和Scr 水平的變化受到藍莓花青素的影響，表明藍莓花青素對糖尿病小鼠的肝腎功能具有改善作用，這與景志行的研究結果一致。在糖尿病的發展中，機體內細胞的過度氧化應激起著重要作用，持續性的高血糖也可能導致體內氧化應激增加。因此，抑制或減少氧化應激可能是預防或延緩糖尿病發病率的一種治療方法。據報道，糖尿病小鼠肝臟和腎臟中的抗氧化酶活性明顯降低，如GSH-Px 和SOD，花青素在高氧化應激條件下（如糖尿病、肥胖癥和高膽固醇血癥）可能具有抗氧化能力，這與本文目前的結論一致。在用藍莓花青素干預后，酶活性增加和MDA 水平的降低，表明藍莓花青素可抑制肝臟、腎臟組織的氧化損傷和脂質過氧化。

綜上所述，藍莓花青素可顯著提高2 型糖尿病小鼠肝臟、腎臟的抗氧化能力，改善2 型糖尿病小鼠肝臟和腎臟的功能，修復高血糖對肝、腎組織細胞的損傷。這些結果為藍莓花青素作為一種能夠預防和緩解2 型糖尿病的潛在的天然功能性食品成分提供了理論基礎。