羅耳阿太菌多糖經(jīng)Nrf2 通路預(yù)防小鼠肝臟鉛損傷機(jī)制

趙 盼，李鴻梅，王志超，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

肝臟是機(jī)體鉛代謝的重要場(chǎng)所，鉛在體內(nèi)隨血液流動(dòng)進(jìn)入肝臟并在肝臟中蓄積，易造成肝臟損傷。1965 年，Wills 發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期過量與鉛接觸會(huì)導(dǎo)致各臟器發(fā)生氧化應(yīng)激。鉛通過直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧和抑制抗氧化防御系統(tǒng)引發(fā)氧化應(yīng)激，對(duì)DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生影響，從而干擾多種生化過程。核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體對(duì)抗外源性刺激的防御機(jī)制之一，Nrf2 信號(hào)通路的激活有利于減輕肝臟鉛損傷。因此，Nrf2 作為改善小鼠肝臟鉛損傷的研究靶點(diǎn)具有重大意義。

螯合劑通常用于治療鉛中毒，但它們被證實(shí)具有多種副作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有改善器官鉛損傷作用，如改善鉛中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶力、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝臟和生殖系統(tǒng)等。羅耳阿太菌多糖（polysaccharides,AEPS）是由羅耳阿太菌（）以玉米淀粉和玉米黃漿為碳源和氮源發(fā)酵分泌的一種胞外多糖，具有良好的吸濕、保濕、抗氧化和螯合金屬離子的性質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)，灌胃AEPS 減少了小鼠體內(nèi)鉛的積累，病理切片也證明AEPS 減輕了小鼠大腦、肝臟、腎臟和睪丸的損傷。然而，AEPS 能否通過調(diào)節(jié)Nrf2 信號(hào)通路改善小鼠肝臟鉛損傷的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在探究AEPS 保護(hù)鉛暴露小鼠肝臟的作用機(jī)制，并通過腹腔注射Nrf2 信號(hào)通路的抑制劑揭示上述作用機(jī)制與Nrf2 信號(hào)通路的聯(lián)系，為開發(fā)安全的能改善器官鉛損傷的功能性食品添加劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅耳阿太菌（） 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室；昆明種小鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001，SPF 級(jí)，雄性，4 周齡） 遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司；EDTA 二鈉鈣和全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA） 美國(guó)Sigma 公司；Nrf2 抗體、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease 3，Cspase-3）抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B lymphocyte tumor-2，Bcl-2）抗體 武漢愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司；多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistanceassociated protein 2，MRP2）抗體 英國(guó)Abcam 公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione-s-transferase，GST）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗、內(nèi)參、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF 膜 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；醋酸鉛 廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

Z36HK 型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Hermle 公司；AA-6200 型火焰原子吸收分光光度計(jì) 日本津島公司；EG1140 型石蠟包埋機(jī)、RM2255 型石蠟切片機(jī)德國(guó)Leica 公司；Olympus BX51 型光學(xué)顯微鏡日本Olympus 公司；NIS-ELEMNT BR 型圖像分析系統(tǒng) 日本尼康公司；Infinite M200Pro 型酶標(biāo)儀瑞士康泰集團(tuán)有限公司；Mini-ProteanTetra 型電泳槽美國(guó)伯樂公司；DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅耳阿太菌多糖的制備 參照文獻(xiàn)[11]培養(yǎng)羅耳阿太菌。發(fā)酵液依次用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)至pH7.0，80 ℃加熱30 min，4 ℃，10000 g 離心30 min。上清液經(jīng)微孔濾膜除菌絲，用10 mg/mL 木瓜蛋白酶脫蛋白，再用無水乙醇沉淀（上清液:乙醇，1:1.7，V/V），透析和冷凍干燥（-50 ℃）后得羅耳阿太菌多糖。羅耳阿太菌多糖的純度為78.91%。羅耳阿太菌多糖由木糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸、塔羅糖和肌糖組成。

1.2.2 動(dòng)物模型與分組 試驗(yàn)程序由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)，所有動(dòng)物手術(shù)都獲得了當(dāng)?shù)貍惱砼鷾?zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2021 04 13 001）。試驗(yàn)開始前，72 只昆明種小鼠適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境7 d（環(huán)境溫度22±1 ℃，環(huán)境濕度60%～65%），自然采光，動(dòng)物自由飲食和飲水。所有小鼠隨機(jī)等分為9 組：空白對(duì)照組（NC）、模型組（MC）、陽(yáng)性對(duì)照組（PC）、AEPS 低劑量組（LD）、AEPS 中劑量組（MD）和AEPS 高劑量組（HD）、ATRA 單獨(dú)組（ATRA+NC）（該組用于驗(yàn)證ATRA 的注射劑量能否抑制小鼠肝臟組織Nrf2 信號(hào)通路）、ATRA 干預(yù)組（ATRA+MC）（該組用于驗(yàn)證鉛暴露小鼠肝臟組織Nrf2 信號(hào)通路能否被ATRA抑制）、ATRA+AEPS 高劑量組（ATRA+HD）（該組用于驗(yàn)證AEPS 是否通過Nrf2 信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)鉛暴露小鼠肝臟組織）。

試驗(yàn)小鼠連續(xù)30 d 自由飲用1 g/L 醋酸鉛水溶液建立鉛中毒小鼠模型。NC 組和ATRA+NC 組小鼠自由飲用12.5 μL/L 醋酸水溶液，持續(xù)30 d，其余組小鼠自由飲用1 g/L 的醋酸鉛水溶液，并補(bǔ)充醋酸溶液保持醋酸濃度為12.5 μL/L，以避免鉛鹽和氫氧化鉛發(fā)生沉淀反應(yīng)。ATRA+NC 組、ATRA+MC 組、ATRA+HD 組小鼠腹腔注射10 mg/kg bw ATRA（ATRA 先用DMSO 溶解，再用玉米油稀釋，ATRA終濃度為0.1 mg/mL，DMSO 終濃度為1%），其余組小鼠腹腔注射含1% DMSO 的玉米油。30 min 后，ATRA+HD 組和HD 組小鼠灌胃400 mg/kg bw AEPS，MD 組和LD 組分別灌胃200 和100 mg/kg bw AEPS，PC 組小鼠灌胃200 mg/kg bw EDTA 鈣二鈉，NC、MC、ATRA+NC 和ATRA+MC 組小鼠灌胃生理鹽水，持續(xù)30 d。30 d 后，小鼠禁食12 h，稱重，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，血液在室溫中靜止放置30 min，4 ℃，2700 g 離心15 min，吸取上清液測(cè)定AST、ALT和LDH 活性。然后迅速收集肝臟組織分為兩個(gè)子樣本，一部分用于組織病理學(xué)觀察，另一部分保存在-80 ℃中用于Western blot 分析、鉛水平和理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 肝臟中鉛含量測(cè)定 肝臟的鉛含量通過石墨爐吸收分光光度法測(cè)定。將保存的肝臟標(biāo)本置于110 ℃的硝化釜中，加入3 mL 氫氟酸和20 mL 混合酸（硝酸:高氯酸，6:1，V/V），在硝化反應(yīng)釜中硝化3 h。硝化至近干，用25 mL 0.1%的稀硝酸溶液溶解樣品，最后，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液的吸光度。肝臟鉛含量按如下公式計(jì)算：

式中：C 表示小鼠肝臟中鉛的濃度，mg/kg；C表示測(cè)試溶液中鉛的濃度，ng/mL；C表示空白對(duì)照溶液中鉛的濃度，ng/mL；V 表示25，mL；f 表示樣品稀釋倍數(shù)；m 表示被檢測(cè)樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 肝臟GSH、GST、SOD、CAT 和MDA 的測(cè)定 取上述保存于-80 ℃的肝臟組織至離心管中，加入生理鹽水（組織:生理鹽水,1:9,W/V），充分勻漿，4 ℃，3400 g 離心10 min，收集上清液，BCA 法測(cè)定上清液中的蛋白濃度。嚴(yán)格遵守試劑盒說明書測(cè)定GST、CAT、SOD 活性和GSH、MDA 含量。

1.2.5 血清中ALT、AST 和LDH 活性的測(cè)定 嚴(yán)格遵守試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 病理切片分析 肝臟組織樣品依次用4%多聚甲醛固定，用100%、95%、90%和80%的乙醇將樣品脫水，用石蠟包埋，切成5 μm 厚的標(biāo)準(zhǔn)切片，用蘇木伊紅染色切片，使用光學(xué)顯微鏡觀察切片，最后用圖像分析系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行分析。

1.2.7 Western blot 檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)并做適當(dāng)修改。取出保存在-80 ℃的小鼠肝臟組織加入裂解液（裂解液:PMSF，1:99，V/V），充分勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃，12000 g 離心10 min，上清液做為肝臟組織的總蛋白保留。提取肝臟核蛋白嚴(yán)格遵守試劑盒說明書進(jìn)行。蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE 凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。膜用脫脂奶粉封閉1 h 后，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜。膜用TBST 清洗，用二抗溶液室溫孵育1 h。用ECL 法在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影蛋白條帶，用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GraphPad Prism 軟件用于分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）的形式顯示。兩組數(shù)據(jù)采用檢驗(yàn)（Student's-test）方法進(jìn)行分析。兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）方法進(jìn)行分析，并使用Tukey-Kramer 進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟鉛含量的影響

如圖1 所示，MC 組小鼠肝臟鉛含量顯著高于NC 組（＜0.05），表明鉛暴露模型建立成功。與MC組相比，PC 組和AEPS 劑量組小鼠肝臟鉛水平顯著降低（＜0.05），表明AEPS 和EDTA 二鈉鈣可抑制鉛在肝臟中積累。相同劑量下，AEPS 抑制鉛積累作用優(yōu)于EDTA 二鈉鈣。ATRA 是Nrf2 信號(hào)通路的抑制劑，通過抑制Nrf2 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移影響Nrf2 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化和解毒的作用。由于NC 組和ATRA+NC 組小鼠均未飲用醋酸鉛溶液，因此兩組肝臟鉛含量低且沒有顯著差異性（＞0.05）。ATRA+MC 組鉛含量顯著高于MC 組（＜0.05），ATRA+HD組鉛含量也顯著高于HD 組（＜0.05），可能的原因是ATRA 抑制了小鼠肝細(xì)胞中將鉛離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的蛋白的表達(dá)，如MRP2。

圖1 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟鉛含量的影響Fig.1 Effects of AEPS on lead levels in liver of lead-exposed mice

2.2 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟中GSH 和GST 的影響

由表1 可知，鉛降低肝臟GSH 含量和GST 活性。與MC 組相比，PC 組和AEPS 劑量組小鼠肝臟GSH 含量和GST 活性被顯著提高（＜0.05）。在相同劑量下，AEPS 提高GST 活性的能力優(yōu)于EDTA二鈉鈣。與NC 組相比，ATRA+NC 組小鼠肝臟GSH含量沒有顯著差異（＞0.05），GST 活性顯著下降（＜0.05）。ATRA+MC 組小鼠肝臟GSH 含量和GST 活性均顯著低于MC 組（＜0.05）。ATRA+HD 組小鼠肝臟GSH 含量和GST 活性也顯著低于HD 組（＜0.05）。結(jié)果表明，AEPS 可能通過影響Nrf2 信號(hào)通路提高鉛暴露小鼠肝臟GSH 含量和GST 活性。

表1 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟GSH 含量和GST 活性的影響Table 1 Effects of AEPS on GSH levels and GST activity in the liver of lead-exposed mice

2.3 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟中抗氧化能力的影響

表2 為AEPS 對(duì)各組小鼠肝臟組織抗氧化能力的影響。相比NC 組，MC 組小鼠肝臟CAT 和SOD活性顯著降低（＜0.05），MDA 水平顯著上升（＜0.05），表明鉛引起小鼠肝臟抗氧化能力的減弱。相比MC組，PC 組和AEPS 劑量組小鼠肝臟CAT 和SOD 活性顯著升高（＜0.05），MDA 水平顯著降低（＜0.05），表明AEPS 和EDTA 二鈉鈣都能提高鉛暴露小鼠肝臟組織的抗氧化能力，且在相同劑量下，AEPS 在升高CAT 活性的表現(xiàn)優(yōu)于EDTA 二鈉鈣。CAT、SOD活性和MDA 水平在NC 組和ATRA+NC 組沒有顯著性差異（＞0.05）。相比MC 組，ATRA+MC 組小鼠肝臟CAT、SOD 活性顯著降低（＜0.05），MDA 水平顯著升高（＜0.05）。相比HD 組，ATRA+HD 組小鼠肝臟CAT、SOD 活性顯著降低（＜0.05），MDA水平顯著升高（＜0.05）。結(jié)果表明，AEPS 的增強(qiáng)鉛暴露小鼠肝臟抗氧化活性作用可被ATRA 抑制。

表2 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 2 Effects of AEPS on the antioxidant activity of the liver in lead-exposed mice

2.4 AEPS 對(duì)血清中AST、ALT 和LDH 的影響

表3 表示的是AEPS 對(duì)小鼠血清AST、ALT 和LDH 活性的影響。相比NC 組，MC 組小鼠血清AST、ALT 和LDH 活性顯著升高（＜0.05），提示鉛影響了小鼠肝功能。與MC 組對(duì)比，PC 組和AEPS 劑量組小鼠血清AST、ALT 和LDH 活性顯著降低（＜0.05），表明AEPS 和EDTA 二鈉鈣能恢復(fù)鉛暴露小鼠肝功能，相同劑量的AEPS 和EDTA 二鈉鈣具有相同的效果。NC 組與ATRA+NC 組小鼠AST、ALT 和LDH活性沒有顯著差異（＞0.05）。ATRA+MC 組AST、ALT 和LDH 活性顯著高于MC 組（＜0.05）。ATRA+HD 組AST、ALT 和LDH 活性顯著高于HD 組（＜0.05）。結(jié)果說明，AEPS 恢復(fù)鉛暴露小鼠肝功能作用可能與Nrf2 信號(hào)通路有關(guān)。

表3 AEPS 對(duì)血清中AST、ALT 和LDH 活性的影響Table 3 Effects of AEPS on AST,ALT and LDH activity in the serum

2.5 肝臟切片評(píng)估

小鼠肝臟組織HE 染色切片結(jié)果如圖2 所示，NC 組小鼠肝臟未觀察到異常，肝細(xì)胞呈索狀排列，肝竇分布清晰，肝細(xì)胞核清晰。ATRA+NC 組小鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)輕微疏松，未見明顯細(xì)胞變性。MC 組小鼠肝臟中央靜脈擴(kuò)張，充血，細(xì)胞胞漿疏松變性，肝索排列紊亂，肝竇間隙分布不清，細(xì)胞核仁不清晰。ATRA+MC 組小鼠肝索排列紊亂，肝細(xì)胞可見大面積嚴(yán)重的疏松變性，細(xì)胞核仁不清晰，胞漿紅染呈嗜酸性。PC 組小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)律，肝細(xì)胞胞漿疏松變性程度得到改善，部分胞漿紅染呈嗜酸性，因此EDTA 二鈉鈣有效緩解了肝損傷。AEPS 劑量依賴性減輕小鼠肝臟損傷。LD 組小鼠核內(nèi)染色質(zhì)分布紊亂，少量核仁模糊不清，肝細(xì)胞胞漿疏松程度得到改善。MD 組小鼠中央靜脈輕微擴(kuò)張輕度充血，肝細(xì)胞排列規(guī)律，核仁清晰，部分細(xì)胞胞漿疏松變性。HD 組小鼠中央靜脈無明顯的擴(kuò)張。與HD 組相比較，ATRA+HD 組小鼠肝細(xì)胞腫脹，肝竇間隙縮小，少量核內(nèi)染色質(zhì)分布紊亂，局部肝細(xì)胞胞漿疏松，表明ATRA 抑制了AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟病理?yè)p傷的改善作用。

圖2 小鼠肝臟組織HE 染色切片（400×）Fig.2 HE staining of the mice liver tissues（400×）

2.6 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟中Nrf2 的影響

結(jié)果如圖3 所示，與NC 組比較，MC 組小鼠肝細(xì)胞核Nrf2 水平顯著升高（＜0.05），表明鉛促進(jìn)了Nrf2 核移位，進(jìn)而啟動(dòng)了機(jī)體自身抵御毒物的防御機(jī)制。與MC 組比較，PC 組和AEPS 劑量組肝細(xì)胞核Nrf2 水平顯著增加（＜0.05），說明EDTA 二鈉鈣和AEPS 具有促進(jìn)Nrf2 核移位的作用。ATRA 單獨(dú)處理沒有影響小鼠肝細(xì)胞核Nrf2 水平。與MC組相比，ATRA+MC 組肝細(xì)胞核Nrf2 水平顯著下降（＜0.05），表明ATRA 抑制了鉛誘導(dǎo)的Nrf2 核移位，并且由AEPS 引起的Nrf2 核移位作用也被ATRA抑制。上述結(jié)果表明，AEPS 可能通過促進(jìn)Nrf2 的核移位激活了Nrf2 信號(hào)通路，而ATRA 抑制了AEPS的Nrf2 激活作用。

圖3 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝細(xì)胞核Nrf2 蛋白水平的影響Fig.3 Effects of AEPS on Nrf2 protein levels in liver cell nucleus of lead-exposed mice

2.7 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟中細(xì)胞凋亡的影響

采用Western blot 方法測(cè)定鉛暴露小鼠肝臟組織中激活型Caspase-3、Bax 和Bcl-2 的表達(dá)水平。如圖4 所示，鉛處理顯著提高激活型Caspase-3 和Bax 表達(dá)水平（＜0.05），顯著降低了Bcl-2 表達(dá)水平（＜0.05），表明鉛誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡。PC 和AEPS劑量組顯著降低激活型Caspase-3 和Bax 水平（＜0.05），顯著提高Bcl-2 水平（＜0.05），并且在相同劑量下，AEPS 的抗凋亡能力強(qiáng)于EDTA 二鈉鈣。與NC 組相比，ATRA+NC 組小鼠肝組織中激活型Caspase-3 和Bax 水平未發(fā)生顯著變化（＞0.05），但Bcl-2水平顯著降低（＜0.05）。ATRA+MC 組激活型Caspase-3 和Bax 水平顯著高于MC 組（＜0.05），Bcl-2 顯著低于MC 組（＜0.05），表明ATRA 加重了鉛引發(fā)的肝細(xì)胞凋亡。與HD 組相比，ATRA+HD 組激活型Caspase-3 和Bax 水平顯著升高（＜0.05），Bcl-2 水平顯著降低（＜0.05），表明ATRA 能抑制AEPS 在小鼠肝臟組織中發(fā)揮的抗凋亡作用。

圖4 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of AEPS on apoptosis of the liver of leadexposed mice

2.8 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟中MRP2 的影響

MRP2 在細(xì)胞中具有運(yùn)輸重金屬的作用。如圖5所示，與NC 組比較，鉛顯著促進(jìn)了小鼠肝臟MRP2的表達(dá)（＜0.05），提高了肝細(xì)胞對(duì)鉛的耐受性。EDTA二鈉鈣對(duì)MRP2 表達(dá)沒有產(chǎn)生影響。與MC 組相比，AEPS 劑量組小鼠肝臟MRP2 水平顯著提高（＜0.05）。ATRA+NC 組與NC 組MRP2 水平?jīng)]有顯著差異（＞0.05）。ATRA+MC 組MRP2 水平顯著低于MC 組（＜0.05）。與HD 組比，ATRA+HD 組MRP2 水平顯著降低（＜0.05），表明腹腔注射ATRA后，AEPS 不能促進(jìn)小鼠肝臟MRP2 的表達(dá)。因此，AEPS 可能通過Nrf2 信號(hào)通路影響鉛暴露小鼠肝臟MRP2 表達(dá)。

圖5 AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟MRP2 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of AEPS on MRP2 protein expression of the liver of lead-exposed mice

3 討論

鉛是一種弱氧化劑，能誘發(fā)肝臟氧化應(yīng)激。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，當(dāng)肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)伴隨脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，因此MDA 能反映肝臟受氧化應(yīng)激侵害的嚴(yán)重程度，MDA 含量越高，表示肝臟受到越嚴(yán)重的氧化損傷。CAT 和SOD 活性直接反映體內(nèi)減少自由基和抵御氧化應(yīng)激的能力。鉛抑制CAT 和SOD 等抗氧化酶的活性，進(jìn)而抑制抗氧化系統(tǒng)，同時(shí)促進(jìn)MDA 的產(chǎn)生，最終誘發(fā)氧化應(yīng)激。試驗(yàn)結(jié)果表明，鉛暴露后小鼠肝臟MDA 水平顯著升高（＜0.05），SOD 和CAT 活性被抑制。試驗(yàn)結(jié)果也表明AEPS 能顯著提高小鼠肝臟CAT 和SOD 活性，降低MDA 含量，提高了鉛暴露小鼠肝臟抗氧化活性并抑制脂質(zhì)過氧化。與EDTA 二鈉鈣相比較，AEPS提高CAT 活性的效果更好。

細(xì)胞凋亡過程是由Caspase 家族和Bcl-2 家族等其他家族蛋白參與的細(xì)胞程序性死亡過程，細(xì)胞凋亡的異常會(huì)引發(fā)多種疾病。Bcl-2 和Bax 是Bcl-2家族中具有相反作用的兩種蛋白，Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡，Bax 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 的減少和Bax 的增加導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使線粒體中的細(xì)胞色素C、Smac 等凋亡相關(guān)因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，活化細(xì)胞質(zhì)中的凋亡啟動(dòng)因子（如Caspase-2、Caspase-9 和Caspase-10）并激活凋亡執(zhí)行因子（如Caspase-3、Caspase-6 和Caspase-7），最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。其中激活型Caspase-3 的激活代表著凋亡已經(jīng)進(jìn)入了不可逆轉(zhuǎn)的階段。本試驗(yàn)結(jié)果說明灌胃AEPS 減少鉛暴露小鼠肝細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax 蛋白表達(dá)水平，增加抑凋亡蛋白Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而減小線粒體膜通透性，抑制凋亡相關(guān)因子與激活型Caspase-3 的結(jié)合，降低激活型Caspase-3 蛋白的表達(dá)，最終抑制肝細(xì)胞凋亡。

AST、ALT 和LDH 是檢查肝功能的重要指標(biāo)。正常情況下，血清中的AST、ALT 和LDH 活性較低，一旦肝臟受損，肝細(xì)胞膜通透性增加使它們釋放到血液中，血清中AST、ALT 和LDH 活性增加。本試驗(yàn)中，MC 組小鼠血清中AST、ALT 和LDH 活性明顯增強(qiáng)，說明肝臟已經(jīng)明顯受損。這與肝臟組織病理學(xué)切片的觀察結(jié)果一致，鉛引起細(xì)胞排列紊亂、肝細(xì)胞質(zhì)疏松變性等異常變化。灌胃AEPS 后，血清中AST、ALT 和LDH 活性均顯著降低（＜0.05），并且肝臟病理學(xué)切片中也顯示出AEPS 具有減輕肝臟損傷的作用。以上結(jié)果表明，AEPS 能保護(hù)鉛暴露小鼠肝臟組織。

MRP2 是多藥耐藥相關(guān)蛋白家族發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)成員，依靠ATP 水解的能量跨膜輸出內(nèi)外源性有毒物質(zhì)。MRP2 在很多組織中都有分布，尤其是在肝臟組織中，參與了肝細(xì)胞有毒物質(zhì)的排出。MRP2 的表達(dá)水平受Nrf2 信號(hào)通路的影響。GSH 是含有豐富巰基的三肽，與某些藥物或毒物（如重金屬）等通過巰基結(jié)合，從而發(fā)揮解毒作用。大量研究表明，GSH 與重金屬化合物形成的共軛復(fù)合物可以被MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)解毒作用。此外，GST 存在于哺乳動(dòng)物的很多組織中，催化內(nèi)源性和外源性毒物與GSH 結(jié)合，在體內(nèi)解毒功能上起到重要的作用。因此，GSH、GST 和MRP2 共同參與了細(xì)胞重金屬的流出。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AEPS 顯著增加了鉛暴露小鼠肝臟MRP2 蛋白水平（＜0.05），并升高肝臟GSH 含量和GST 活性，減少鉛在小鼠肝臟的累積。

Nrf2 信號(hào)通路是機(jī)體應(yīng)對(duì)外源性刺激的防御機(jī)制之一，能有效抵御氧化應(yīng)激，保護(hù)機(jī)體免受外源性毒物的傷害。正常生理狀態(tài)下，Nrf2 在細(xì)胞漿中與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）結(jié)合，被不斷泛素化降解。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2 脫離Keap1，向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞核內(nèi)，Nrf2 結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant-Response Element,ARE），促進(jìn)下游抗氧化酶基因和MRPs 家族基因的轉(zhuǎn)錄，以此提高機(jī)體抗氧化和解毒能力，防止機(jī)體氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 信號(hào)通路的激活能緩解鉛毒性引起的損傷。試驗(yàn)結(jié)果表明，AEPS 促進(jìn)Nrf2 轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，激活了Nrf2 信號(hào)通路，肝臟的病理?yè)p傷也得到了改善。ATRA 是一種Nrf2 特異性抑制劑，通過影響Nrf2 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移抑制Nrf2 信號(hào)通路的激活。試驗(yàn)結(jié)果表明AEPS 促進(jìn)Nrf2 核移位作用被ATRA 抑制，導(dǎo)致AEPS 不能通過Nrf2 信號(hào)通路保護(hù)鉛暴露小鼠肝臟組織。除此之外，AEPS 的抗氧化、抗凋亡、減少肝臟鉛積累和減輕肝臟鉛損傷作用都受到ATRA 抑制，說明AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟的保護(hù)作用與Nrf2 信號(hào)通路相關(guān)。

4 結(jié)論

AEPS 提高了鉛暴露小鼠肝臟的抗氧化酶活性，緩解了鉛誘導(dǎo)的肝臟損傷和肝細(xì)胞凋亡，提高了GSH 含量和GST 活性，增強(qiáng)了肝臟MRP2 輸出鉛的能力，減少了肝臟鉛積累。這些作用都與AEPS能促進(jìn)Nrf2 核移位有關(guān)，即AEPS 對(duì)鉛暴露小鼠肝臟的保護(hù)作用依賴于Nrf2 信號(hào)通路。因此，AEPS可以作為一種能改善器官鉛損傷并能減少器官鉛積累的功能性食品添加劑。