lncRNA-HMGCS1 的靶基因預測及信號通路富集分析

肖 楊，蔣 振

（川北醫學院基礎醫學與法醫學院生物化學與分子生物學教研室，四川 南充 637000）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作用范圍廣、功能多未探索，近年來引起了廣泛關注。研究發現，lncRNA 在多種疾病的發生發展過程中發揮著調控作用，其與多種疾病的發生發展及預后密切相關。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 合成酶1（HMGCS1）是甲羥戊酸（MVA）途徑的限速酶，催化HMG-CoA 的合成，HMGCR 的底物是MVA 的中間體[1-4]。HMGCS 有兩種亞型，細胞溶質HMGCS1和線粒體HMGCS2。研究發現[5，6]，HMGCS1 基因組擴增和突變涉及各種腫瘤類型，尤其是乳腺癌和肺癌。作為MVA 的中間體，HMG-CoA 也可以被HMGCl 催化產生酮體。HMGCS1 可通過HMGCL-乙酰乙酸軸增強BRAFV600E 依賴性MEK1 激活，從而促進BRAFV600E 陽性黑色素瘤的細胞增殖和腫瘤生長[7-10]。研究發現，甲羥戊酸（MVA）信號通路中的HMGCS1 在結腸癌組織中過表達，并正向調節細胞增殖及結腸癌細胞的遷移和侵襲。此外，HMGCS1 可增強PERK 的活性而不依賴于MVA 途徑，抑制HMGCS1 可完全降低EGF 誘導的結腸癌細胞增殖[11-14]。然而，HMGCS1 在細胞內的作用及其在疾病發展中的作用仍不明確。為了全面闡明長鏈非編碼RNA HMGCS1 在細胞內所調控的分子功能及生物學過程，本研究擬運用生物信息學方法，分析lncRNA-HMGCS1 在細胞內的調控靶基因及信號通路，并對其進行生物學功能注釋，闡述lncRNAHMGCS1 在細胞內的功能作用和分子機制。

1 資料與方法

1.1 lncRNA-HMGCS1 靶基因預測 經NCBI 基因數據庫查詢lncRNA-HMGCS1 的序列，經miRDB 數據庫（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 數據庫（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預測與lncRNA-HMGCS1 有miRNA-lncRNA 互作關系的miRNA，將miRDB 數據庫預測到miRNA 與Starbase3.0數據庫預測到的miRNA 選取2 個數據庫的交集進行進一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因預測 在Starbase3.0 數據庫中分別對這些miRNA 進行靶基因預測，選取預測程序個數為3，預測到靶基因的評分比較高的前5 個，通過David數據庫（www.ncifcrf.gov）進行靶基因的GO 注釋和信號通路富集分析。

1.3 GO 注釋 在David 數據庫中對選取的miRNAs靶基因結果進行功能注釋（GO analysis），主要從基因功能的4 個方面進行：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）和信號通路（pathways）。得到具有統計學意義的GO 注釋顯著性分析（P≤0.05），同樣信號通路富集分析閾值取P≤0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA-HMGCS1 預測miRNAs 結果顯示，在miRDB 數據庫預測到與lncRNA-HMGCS1 有miRNA-lncRNA 互作關系的miRNAs95 個，Starbase3.0數據庫預測到167 個；取兩者交集共有14 個miRNA，是在Starbase3.0 數據庫預測程序數為3 時能預測到靶基因的miRNA，具體如下：hsa-miR-543、hsamiR-429、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-496、hsa-miR-206、hsamiR-4735-3p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-2355-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-579-3p、hsa-miR-450b-5p。

2.2 GO 注釋分析 選取其中評分較高的前2 個miRNA 進行靶基因預測，再運用數據庫對結果中的靶基因進行GO 功能注釋。結果顯示，lncRNAHMGCS1 通過hsa-miR-543 作用的靶基因主要調控細胞內轉運、內質網到高爾基復合體物質轉運、調控細胞周期、染色質組裝、細胞分裂以及蛋白質磷酸化等生物學過程；通過hsa-miR-543 作用的細胞內分子功能主要有轉錄調控區序列特異性DNA 結合、轉錄因子結合、轉錄協作因子活性、組蛋白結合、GDP 結合、GDP 結合、ATPase 結合及染色質結合等功能；長鏈非編碼RNA HMGCS1 通過hsa-miR-429作用的靶基因主要調控細胞周期、凋亡過程、RNA剪接、細胞應對DNA 損傷反應、細胞內蛋白轉運、細胞分裂、細胞內信號傳導、蛋白磷酸化與去磷酸化、染色質重塑、蛋白質泛素化以及負性調控細胞增殖等生物學過程；通過hsa-miR-429 作用的細胞內分子功能主要有ATP 結合、泛素化蛋白連接酶活性、RNA 聚合酶Ⅱ序列特異性DNA 結合轉錄因子結合、PDZ 結構域結合、蛋白激酶活性、小GTPase 結合及序列特異性DNA 結合等分子功能，見圖1。

圖1 GO 注釋分析

圖1 GO 注釋分析（續）

2.3 信號通路富集分析 選取評分較高的前2 個miRNA 進行信號通路富集，結果顯示，長鏈非編碼RNA HMGCS1 通過hsa-miR-543 作用的信號通路包括細胞衰老泛素化介導的蛋白質降解、晝夜節律、FoxO 信號途徑、生長激素合成分泌和作用、TGFbeta 信號通路、人T 細胞白血病病毒1 感染、腫瘤信號通路、Kaposi 肉瘤相關皰疹病毒感染、MAPK 信號通路、VEGF 信號通路以及自噬信號通路等；長鏈非編碼RNA HMGCS1 通過hsa-miR-429 作用的信號通路包括神經營養素信號通路、腫瘤中的糖蛋白信號通路、FoxO 信號通路、泛素介導的蛋白降解信號通路、Ras 信號通路、人乳頭狀瘤病毒感染、MAPK信號通路、細胞衰老以及自噬信號通路等，見圖2。

圖2 富集通路分析

3 討論

HMGCS1 是甲羥戊酸途徑中的一個潛在調節節點，在多種疾病中發生突變[15-18]，其表達在腫瘤中普遍失調。癌癥基因組學數據集顯示，HMGCS1 在胃癌、乳腺癌和肺癌等多種癌癥中得到擴增，HMGCS1 可促進細胞增殖，如HMGCS1 介導的膽固醇生物合成促進結直腸癌細胞的增殖和生長。

HMGCS1 可通過HMGCL-乙酰乙酸軸增強，MEK1 的激活，從而促進黑色素瘤的細胞增殖和腫瘤生長，其在細胞生長、分化、個體發育等方面發揮重要作用[19-21]。本研究通過分析lncRNA-HMGCS1 的靶基因，并進一步分析其在細胞內調控的信號通路。

本次研究在miRDB 數據庫預測到lncRNAHMGCS1 相關的miRNAs 共95 個，同時在Starbase3.0數據庫預測到miRNAs 共167 個，取交集共得到14個miRNAs，分別是hsa-miR-543，hsa-miR-429，hsa-miR-200b-3p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-496，hsa-miR-206，hsa-miR-4735-3p，hsa-miR-18b-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-2355-3p，hsa-miR-664b-3p，hsa-miR-579-3p，hsa-miR-450b-5p。對評分較高的前2 個miRNA 通過GO 功能注釋發現，lncRNA-HMGCS1 通過hsa-miR-543主要調控細胞內物質轉運，比如內質網到高爾基復合體物質轉運。還調控細胞周期、染色質組裝、細胞分裂以及蛋白質磷酸化等生物學過程。同時，作用的細胞內分子功能主要有轉錄調控區序列特異性DNA 結合、轉錄因子結合、轉錄協作因子活性及組蛋白結合等。此外，通過hsa-miR-429 的靶基因主要包括細胞應對DNA 損傷反應、細胞內蛋白轉運、細胞分裂、細胞內信號傳導、蛋白磷酸化與去磷酸化、染色質重塑、蛋白質泛素化，以及負性調控細胞增殖等生物學過程，表明其生物學功能主要跟細胞內的轉錄調控、轉錄因子結合及蛋白質結合密切相關。

進一步研究顯示，lncRNA-HMGCS1 在細胞內作用的信號通路包括細胞衰老泛素化介導的蛋白質降解、晝夜節律、FoxO 信號途徑、生長激素合成分泌和作用、TGF-beta 信號通路，提示它們的功能主要與細胞衰老、細胞節律、細胞長時程增強以及泛素介導的蛋白降解等方面相關。另一方面，通過hsamiR-429 作用的信號通路包括神經營養素信號通路、腫瘤中的糖蛋白信號通路、FoxO 信號通路、泛素介導的蛋白降解信號通路及Ras 信號通路等，提示其與細胞內的神經營養、腫瘤形成、蛋白降解等多種病理生理過程相關。然而，HMGCS1 的作用十分廣泛，研究顯示HMGCS1 可增強整合應激反應（ISR），并與內質網應激轉導蛋白激酶RNA 樣內質網激酶（PERK）相互作用，以代謝和非代謝方式促進胃癌的進展。

綜上所述，lncRNA-HMGCS1 在細胞內調控的多個靶基因和信號通路，涉及到多種細胞內的生理和病理過程，與疾病的發生發展密切相關，長鏈非編碼RNA-HMGCS1 是有潛力的疾病診斷或治療靶點。