TIM-3 在常見腫瘤中的表達研究

薛 飛，趙穎海

（廣東醫科大學病理系，廣東 湛江 524023）

21 世紀以來，腫瘤免疫興起，免疫治療逐漸得到重視，如阻斷腫瘤負向免疫調控機制的抗CTLA-4和PD-1 或PDL-1 抗體、嵌合抗原受體T 細胞、腫瘤樹突狀細胞疫苗等逐步展開。針對傳統的CTLA-4、PD-1/PDL-1 等免疫檢查點的阻斷策略已經取得較大的成功，現階段迫切需要發掘和研究新的免疫抑制點。作為新型免疫檢查點之一的TIM-3，其表達及功能為近年來研究熱點之一，已被發現在多個系統的常見的惡性腫瘤中發揮作用。目前，檢測TIM-3表達的方法較多，不同研究常常出現多種聯合檢測方法，并且TIM-3 表達方式多樣。針對TIM-3 的具體表達模式及不同實驗技術方法檢測下其表達意義是否一致，本文通過分納歸類不同實驗技術方法檢測下常見腫瘤中TIM-3 表達的狀態及意義，旨在全面的認識TIM-3。

1 TIM-3 及其配體

TIM 基因家族于2001 年被發現，在人類中，該基因成員位于5q33.2 染色體帶上，包括HAVCR1、HAVCR2 和TIMD4，分別編碼TIM-1、TIM-3 和TIM-4 分子，其中TIM-3 受到更多關注。TIM-3 是一種跨膜蛋白，分為胞外區、跨膜區及胞內區，其中胞外區由IgV 結構域（含有N-連接糖基化位點）和粘蛋白樣結構域（含有O-連接糖基化位點）組成，而胞內區為其胞漿尾巴[1]。TIM-3 表達于多種免疫細胞，研究發現，TIM-3 主要表達于Th1 細胞，另外也可在Th17 細胞、調節性T 細胞（Regulatory T cells，Tregs）、CD8+T 細胞、樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）、單核細胞、巨噬細胞和NK 細胞上表達等[2]，在調節細胞免疫及先天免疫中起重要作用。目前，已知TIM-3 的配體[3，4]包括半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9），磷脂酰絲氨酸（PtdSer），高遷移率族蛋白1（HMGB-1）及癌胚抗原細胞粘附分子1（CEACAM-1）。GAL-9 廣泛于表達多種細胞，能特異性識別TIM-3 IgV 結構域，最常見的作用是與TIM-3 結合后通過改變細胞內的鈣離子流量，誘導Th1 細胞凋亡，從而抑制腫瘤免疫。PtdSer 常暴露在凋亡細胞的細胞膜上，可識別樹突狀細胞（DC）上的TIM-3，介導抗原交叉提呈。HMGB-1 是由免疫細胞分泌的一種炎癥介質，正常情況下，HMGB-1 先與細胞死亡后暴露的核酸結合，并在與晚期糖基化終產物和Toll 樣受體結合后，介導內化將其運輸至DC 內體小泡，從而觸發免疫反應。在腫瘤微環境中，HMGB1 高表達于腫瘤浸潤性DC，TIM-3 與HMGB1 結合，阻斷其核酸向內體運輸，從而抑制先天免疫反應。CEACAM-1 是最新發現的TIM-3 的配體，可通過順式二聚體相互作用促進TIM-3 的成熟和穩定，抑制T 細胞活性，目前被認為在某些抗病毒反應中起調節作用。

2 不同實驗技術檢測TIM-3 的表達

2.1 流式細胞術 流式細胞儀為集光電子物理、光電測量、計算機、細胞熒光化學、抗體技術為一體的高科技細胞分析儀，流式細胞術則是利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數、快速的定量分析和分選的技術，已知不少研究運用這一技術檢測TIM-3 的表達。研究發現，TIM-3 常常在腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）表達上調。其中，Gao X 等[5]和吉芃等[6]發現，在非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancers，NSCLC）中CD4+TIL 上TIM-3 的表達水平與患者生存預后呈負相關；Zhou GY 等[7]在研究原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）時也觀察到瘤內CD4+和CD8+T 細胞上TIM-3 的表達高于癌旁組織。另外，TIM-3 在腫瘤患者外周血中同樣有表達上調。Takano S 等[8]檢測胃癌患者腫瘤組織和外周血中CD8+T 細胞表面TIM-3 和PD-1 的表達時發現，相比于健康對照組，兩者CD8+T 細胞表達PD-1 和TIM-3 均有上調，其中腫瘤組織內PD-1+CD8+T 細胞和TIM-3+CD8+T 細胞數量明顯多于外周血。此外，該研究還發現共表達PD-1 和TIM-3 的CD8+T細胞分泌IFN-γ 的功能顯著低于PD-1-TIM-3-和PD-1+TIM-3-CD8+T 細胞，提示TIM-3 和PD-1 的表達與CD8+T 細胞功能受損相關。Piao YR 等[9]研究發現，前列腺癌患者外周血CD4+和CD8+T 細胞上TIM-3 的表達均明顯高于良性前列腺增生患者，Zhang W 等[10]研究顯示，膀胱癌患者外周血NK 細胞TIM-3 顯著上調，TIM-3+NK 細胞毒性顯著降低，TIM-3+NK 細胞頻率越高的患者相應腫瘤細胞Gal-9 陽性率越高，并與患者預后總體呈負相關。Li XE 等[11]研究發現，膠質瘤患者外周血CD3-CD56+NK 細胞數量明顯減少，不僅如此，TIM-3 在CD3-CD56+NK 細胞和CD14+單核細胞的表達均高于健康對照組，其表達水平與患者腫瘤細胞Ki-67指數呈正相關。另外，該研究還表明，TIM-3+NK 細胞分泌IFN-γ 能力明顯降低，TIM-3+單核細胞表現為M2 表型數量上升，TIM-3 在膠質瘤的免疫中起負性調節作用。總之，TIM-3 的高表達與患者的不良預后相關，TIM-3 的上調可能導致相關免疫細胞功能的受損，從而促進腫瘤的發生發展，這一點在關于食管癌[12]、結直腸癌[13]、濾泡性細胞淋巴瘤[14]等的研究中也得到了證實。

2.2 免疫組織化學法 免疫組織化學通過抗體與所識別的組織或細胞中的抗原成分的特異性結合來鑒定目標抗原分子，常常由兩個要素組成，即識別組織或細胞中的抗原成分的抗體以及標記于抗體上的示蹤劑。示蹤劑包括酶分子，熒光素分子和重金屬原子等，而根據示蹤劑的不同可將免疫組織化學分為免疫熒光、免疫酶技術、免疫電鏡等。Li Z 等[15]運用免疫組織化學法檢測發現，HCC 組織中TIL 上TIM-3 的表達明顯高于癌旁組織，同樣表達上調的還有PD-1，兩者表達呈正相關，其表達水平與腫瘤的分級顯著相關。Wang YY 等[16]發現，TIM-3 與食管胃交界部腺癌患者Siewert 分型密切相關，TIM-3 主要表達于TIL，TIM-3 和Gal-9（腫瘤細胞上表達）雙陽性者預后顯然更差。同樣，Liu ZJ 等[17]研究顯示，瘤內Gal-9 的表達與TIL 上TIM-3 的表達水平與膠質瘤的WHO 分級有關。TIM-3 不僅可表達于免疫細胞，也可以表達于腫瘤細胞。有關子宮內膜癌[18]及宮頸癌[19]的研究表明，與癌旁或良性組織對比，TIM-3 既可在TIL 中高表達，也可在腫瘤細胞中過表達。前者展開關于TIM-3 與錯配修復蛋白在子宮內膜癌的表達研究，其結果表明，在MLH1 高甲基化、MSH6 缺失和中-高級別組織學分級的情況下，腫瘤細胞TIM-3 的表達水平明顯增高，提示抗TIM-3 治療在子宮內膜癌或林奇綜合征患者中起潛在作用；后者檢測分析TIM-3 與Gal-9 及PDL-1的關系，發現86%的PD-L1 陽性病例，包括100%PD-L1 陽性宮頸鱗癌中存在TIM-3/Gal-9 雙重表達，提示抗TIM-3 與抗PD-1/PD-L1 可能具有協同作用。在結直腸癌的相關研究中，有研究顯示[20]，TIM-3 在腫瘤組織中的表達水平高于正常組織，其表達水平與腫瘤大小、TNM 分期和遠處轉移顯著相關。但Sun QY 等[21]的研究相反，該研究結合了TIM-3mRNA 的檢測及TIM-3 蛋白水平定量，顯示TIM-3 在結腸癌組織中的表達低于正常組織和癌旁組織，其與臨床病理參數的分析表明，TIM-3 表達下調與大腸癌的侵襲和轉移有關。類似的爭議還有，如Piao YR 等[9]發現TIM-3 在前列腺腫瘤組織（含上皮內瘤變及腺癌）中的表達明顯高于瘤旁組織，與前列腺特異性抗原水平呈正相關，TIM-3 高表達提示前列腺癌患者的不良預后。然而，Wu JL 等[22]研究顯示，TIM-3 表達陰性的轉移性前列腺癌和轉移性去勢抵抗性前列腺癌患者的總生存期較短，可作為兩者預后不良的獨立預測因素。另外，還有研究表明[23]，TIM-3 在腎細胞癌原發灶或轉移瘤中的表達與患者較長的無進展生存和總生存期有關。運用免疫組織化學法進行TIM-3 研究的常見原發腫瘤還包括胰腺癌[24]、食管癌[25，26]、口腔癌[27]、頭頸部鱗狀細胞癌[28]、乳腺癌[29]、肺癌[30]等，涵蓋多個系統。總體而言，均較一致地顯示TIM-3 在腫瘤組織中的表達高于瘤旁，且與患者TMN 分期呈正相關，這與運用流式細胞術檢測TIM-3 的結果基本相符，但TIM-3 在部分腫瘤的表達及作用仍存在爭議，還需要進一步的研究來驗證。

2.3 聚合酶鏈反應/連接酶檢測反應（PCR-LDR）基因多態性又稱遺傳多態性，是指一個生物群體中同時和經常存在兩種或多種不連續的變異型或基因型或等位基因。關于TIM-3 基因多態性與癌癥風險關系的研究發現[31]，TIM-3 單核苷酸多態性與多種人類癌癥的易感性相關。Cui SJ 等[32]采用PCR-LDR 法檢測TIM-3 的基因多態性，結果顯示TIM-3 rs10053538C＞A 等位基因可增加食管癌的發病風險，并通過調節TIM-3 的表達影響患者的預后。Liu YB 等[33]研究發現，TIM-3 rs10053538 和rs10515746 與大腸癌的易感性無關，然而，rs10053538 的CA+AA 基因型與晚期臨床分期和淋巴結轉移風險增加有關，攜帶rs10053538 的CA+AA 基因型患者的無病生存期和總生存期明顯短于CC 基因型患者，這一點在Wu JL 等[34]關于卵巢癌與TIM-3 基因多態性的關系的研究得出的結論基本一致。除此以外，有關乳腺癌[35]的研究報道，TIM-3 rs10053538GT+TT 基因型不僅增加乳腺癌的遺傳易感性，還與TIM-3 高表達和淋巴結轉移情況相關。由此可見，越來越多的證據顯示，TIM-3 基因的多態性與腫瘤的發生發展有著一定的聯系。

2.4 多種聚合酶鏈反應（PCR）目前常用的方法包括逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）等，TIM-3 mRNA 的檢測可以較為直觀且準確地反映TIM-3 基因的表達，避免某種情況下基因表達不完全反映在蛋白水平中。檢測標本來源可分為患者的血液、腫瘤病灶或培養的腫瘤細胞系等。Yu MM 等[20]提取腸癌組織和癌旁組織的總RNA 進行RT-qPCR 分析，結果顯示腫瘤組織內TIM-3 mRNA 表達水平是癌旁組織的5 倍以上。有學者[36]系統地研究了與免疫逃逸和T 細胞耗竭有關的不同基因在結直腸癌患者的腫瘤組織、配對的正常組織及血循環中的表達水平，結果顯示，盡管結直腸癌患者循環中TIM-3 mRNA 表達水平與健康人相似，但腸癌組織中包括TIM-3 在內的多個免疫抑制點的mRNA 水平顯著升高，提示患者機體的免疫功能受抑狀態。另外，研究對比結直腸癌早期和晚期之間基因表達差異顯示，TIM-3 mRNA 在晚期腫瘤組織中表達升高，提示其在結直腸癌進展中可能起作用。除此以外，已知在食管癌[12]、卵巢癌[34]、乳腺癌[37]、宮頸癌[38]等多種腫瘤中，腫瘤細胞或TIL 中TIM-3 mRNA 的表達水平均明顯升高，并與腫瘤組織學分級、淋巴結轉移等呈正相關，與患者的預后呈負相關。

2.5 蛋白質免疫印跡（Western blot）通過Western blot 法將蛋白質轉移到膜上，利用抗體進行檢測，可定量或定性確定細胞或組織中蛋白質的表達情況。檢測標本常常是腫瘤病灶或培養的腫瘤細胞系。目前已應在胃癌[39]、結直腸癌[20]、乳腺癌[29，37]及宮頸癌[38]等中發現，TIM-3 表達上調往往提示患者的預后不良。

2.6 體外細胞實驗 體外細胞實驗包括細胞遷徙侵襲檢測、Transwell 實驗、細胞凋亡檢測、細胞增殖檢測等，主要應用于目標腫瘤細胞系的研究。Cheng SQ等[29]通過AdV-TIM-3 上調和TIM-3-siRNA 下調TIM-3 在乳腺癌細胞系中的表達水平，證實TIM-3過表達可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，而TIM-3 失表達則作用相反，這點與TIM-3 在宮頸癌細胞系[38]中的研究結論一致。郭艷等[39]研究發現，TIM-3 在胃癌組織CD4+TIL 細胞中呈高表達狀態，TIM-3 高表達可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌AGS 細胞增殖、侵襲，從而促進胃癌進展。淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）也是一種免疫檢查點，作為T細胞穩態的負調節因子，常常表達于活化的CD4+、CD8+和NK 細胞，Chen BJ 等[40]將彌漫大B 細胞淋巴瘤細胞系與預置的T 細胞在抗LAG-3 和抗TIM-3的條件下共培養，觀察發現腫瘤細胞死亡率呈劑量依賴性增加，驗證了阻斷TIM-3 或LAG-3 可以誘導CD8+T 細胞的抗淋巴瘤活性。總之，通過體外細胞功能實驗同樣證實，TIM-3 至少在多種常見腫瘤的進展中起一定的作用，TIM-3 可作為潛在的預后標記物。

2.7 動物實驗 現已發現攜帶實體瘤的小鼠體內CD8+TIL 上可表達TIM-3，且同時表達PD-1。PD-1除了作為較早期被發現的免疫檢查點之一并與其配體PDL-1 被廣泛研究外，還被認為是慢性疾病中耗竭狀態T 細胞的一種標記。有研究[41]分離荷瘤小鼠CD8+TIL，并在體外直接檢測其分泌細胞因子的功能。結果發現，與TIM-3-PD-1+TIL 和TIM-3-PD-1-TIL 相比，TIM-3+PD-1+TIL 表現出最嚴重的衰竭狀態，表現為不能增殖和產生IL-2、腫瘤壞死因子和干擾素-γ。已有研究發現[28]，在TIM3 過表達的Tgfbr1/Pten2cKO 頭頸部鱗狀細胞癌小鼠模型中，抗TIM-3 單抗可通過靶向CD4+TIM-3+細胞和CD8+TIM-3+細胞，減少髓系來源的抑制細胞，恢復效應T細胞功能，有效抑制腫瘤生長。曲美替尼作為一種絲裂原激活的細胞外信號調節激酶（MEK）抑制劑，已被證明對晚期黑色素瘤患者有效。Liu Y 等[42]將曲美替尼和抗TIM-3 單克隆抗體（MAb）聯合治療B16-F10 黑色素瘤小鼠，結果發現抗TIM-3 單抗可對抗MEK 抑制劑帶來的促TIM-3 表達的作用，通過刺激CD8+T 細胞增強其抗腫瘤免疫功能。上述的動物實驗無一不進一步說明TIM-3 在腫瘤免疫中起負性調節作用，TIM-3 靶向治療不容忽視。

3 總結

在單種或多種不同實驗技術方法聯合檢測下，TIM-3 的作用逐漸清晰，其在腫瘤免疫中的作用不可忽視。TIM-3 基因的多態性與腫瘤的發生發展有著一定的聯系，TIM-3 表達（包括蛋白質、mRNA）更是涵蓋多個系統常見惡性腫瘤，包括呼吸系統、消化系統、泌尿生殖系統、淋巴造血系統、神經系統等，其表達不限于CD4+T、CD8+T 細胞、NK 細胞等免疫細胞以及部分腫瘤細胞。在這些腫瘤中，TIM-3 往往處于高表達狀態，通過誘導Th1 細胞凋亡，損害CD8+T細胞及NK 細胞免疫功能，以及與PD-1 共表達加重T 細胞“耗竭狀態”等途徑對抗腫瘤免疫。盡管目前依然存在一些爭議，但越來越多的研究證實，TIM-3 的高表達往往是惡性腫瘤患者不良預后的重要因素之一，在未來TIM-3 有望成為評估腫瘤預后的新指標。