鼻咽癌中IKKβ 和Ki-67 的表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

周 梅，趙 剛 ，禤瑞霞，陳鈺偉，汪 蕓，封慕茵

（中山市中醫(yī)院病理科1，超聲科2，廣東 中山 528400）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)鼻咽癌患者超過8.4 萬人，鼻咽癌在東南亞和中國南部非常普遍[1]。鼻咽癌是一種低分化或未分化癌，對放療較敏感，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向，因此，對于分期低非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的治療建議采用放療，治愈率較高[2]。然而，由于早期鼻咽癌患者癥狀輕微，大多數(shù)患者就診時已為晚期，主要采用多種聯(lián)合放化療模式治療，但鼻咽癌Ⅲ期和Ⅳ期5 年總生存率僅為53%～80%和28%～61%[3]。迄今為止，鼻咽癌的基因組異常仍不明確，沒有相應(yīng)的靶向治療。因此，尋找能夠預(yù)測鼻咽癌預(yù)后或指導(dǎo)靶向治療的分子靶點具有重要意義。NFКBp65 通路是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、凋亡、胚胎發(fā)育、衰老和癌癥的重要核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通路[4]。NF-κB 通路活化受IκB 激酶（IKK）復(fù)合物調(diào)節(jié)，該復(fù)合物由2 個催化亞單位IKKα 和IKKβ 以及一個調(diào)節(jié)亞單位（NEMO）/IKKγ 組成[5]。IKKβ 是激活經(jīng)典NF-κB 信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，據(jù)文獻(xiàn)報道NF-κB 信號通路在多種惡性腫瘤中激活，如頭頸部腫瘤、胃腸道腫瘤、婦科腫瘤、胸部腫瘤和泌尿生殖系腫瘤等。細(xì)胞增殖指數(shù)（Ki-67）是評估腫瘤異質(zhì)性和細(xì)胞生長的重要免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，參與細(xì)胞增殖、侵襲性和惡性潛能[6]。廣東省是鼻咽癌的高發(fā)地區(qū)，IKKβ 是否與廣東省鼻咽癌患者的發(fā)病相關(guān)尚不明確。基于此，本研究運用免疫組化及RT-PCR 的方法檢測IKKβ 蛋白mRNA 在鼻咽癌患者組織中的表達(dá)，分析其與鼻咽癌各臨床病理指標(biāo)及Ki-67 增殖指數(shù)間的關(guān)系，探討IKKβ在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為靶向治療和預(yù)后判斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018 年1 月-2019 年12 月中山市中醫(yī)院門診鼻咽疾病患者90 例，其中鼻咽癌60例，男41 例，女19 例；年齡16～80 歲，平均年齡（49.13±14.02）歲。鼻咽炎30 例，男20 例，女10 例；年齡18～70 歲，平均年齡（45.18±15.63）歲。手術(shù)活檢標(biāo)本經(jīng)病理證實為鼻咽癌，所有病理切片由2 名病理醫(yī)師同時閱片，根據(jù)分化程度，鼻咽癌可分為3種組織學(xué)類型：非角化性癌（分化型和未分化型）、角化性和基底樣型鱗狀細(xì)胞癌。鼻咽癌的組織學(xué)分型及分期標(biāo)準(zhǔn)參照2006 年世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) IKKβ 一抗購自Santa Cruz 公司，Ki-67 一抗及二抗購自福州邁新公司。所有樣本均按照說明書的程序處理。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上，用二甲苯和酒精脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原4 min，加過氧化氫10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，切片用10% 的山羊血清阻斷，IKKβ 和Ki-67（1∶100）一抗孵育2 h，二抗孵育30 min，DAB 顯色，脫水，封片。

1.2.2 結(jié)果判定 結(jié)果由2 位病理科醫(yī)師進(jìn)行判定，采用雙定量評分法進(jìn)行評定：IKKβ 蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki-67 蛋白陽性表達(dá)為胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽性染色強度評分：無染色顆粒為0 分，微弱染色顆粒為1 分，清晰染色顆粒且細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為2 分，細(xì)胞質(zhì)呈深棕色為3 分；陽性細(xì)胞數(shù)評分：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞數(shù)≤20%為1 分，陽性細(xì)胞數(shù)21%～50%為2 分，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為3 分；上述兩項評分相乘，0～2 分為陰性，≥3 分為陽性表達(dá)。

1.2.3 提取總RNA、合成cDNA 所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定和石蠟包埋后，連續(xù)切片6 片，厚6 μm，使用總RNA 提取試劑盒（美國，QIAGEN）提取組織總RNA，用紫外分光法測取RNA 純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 生物公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將500 ng 總RNA 加入20 μl 反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件：37 ℃15 min、85 ℃5 s、4 ℃延伸，獲得cDNA 后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RT-PCR 檢測IKKβmRNA 的相對表達(dá)量 采用RT-PCR 法對IKKβmRNA 的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。RT-PCR 具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物由上海生工生物公司設(shè)計合成，以GAPD 為內(nèi)參，具體如下：IKKβ-上游引物：5'-CCGACAGAGTTAGCACGACA -3'，IKKβ -下游引物 ：5' -GGCAATCTGCTCACCTGTTT-3'；內(nèi)參GAPDH-上游引物：5'-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3'，GAPDH-下游引物：5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3'。PCR 反應(yīng)體系：SYBR 10 μl，cDNA2 μl，上、下游引物各0.4 μl，去離子水7.2 μl；在RT-PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，擴增條件為：95 ℃30 min 預(yù)變性；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)；繪制溶解曲線：95 ℃15 min、60 ℃15 s、95 ℃15 s。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)檢測3 次，取平均值。以GAPDH 為內(nèi)參照，計算目的基因的相對表達(dá)量。計算公式:ΔΔCt=（CT 實驗組目的基因-CT 實驗組管家基因）-（CT 對照組目的基因-CT 對照組管家基因）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗；偏態(tài)分布的計量資料以[M（P25，P75）]表示，并采用Mann-WhitneyU檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IKKβ 和Ki-67 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎組織中的表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)方法檢測顯示，IKKβ 蛋白在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較多，著色深，呈強陽性表達(dá)，而在鼻咽炎中呈弱陽性表達(dá)或陰性，見圖1；IKKβ 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率為56.67%，在鼻咽炎組織中的陽性表達(dá)率為33.33%，IKKβ 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率高于鼻咽炎組織（P＜0.05）；Ki-67 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率為95.00%，在鼻咽炎組織中的陽性表達(dá)率為13.33%，Ki-67 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率高于鼻咽炎組織（P＜0.05），見表1。

表1 IKKβ 和Ki-67 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎組織中的表達(dá)比較[n（%）]

圖1 免疫組化染色

2.2 鼻咽癌組織中IKKβ 和Ki-67 蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Pearson 線性相關(guān)分析顯示，鼻咽癌組織中IKKβ 和Ki-67 蛋白的相對表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.262，P＜0.05）。

2.3 IKKβ mRNA 在鼻咽癌組織與鼻咽炎組織中表達(dá)比較 IKKβ mRNA 的表達(dá)溶解曲線和擴增循環(huán)圖見圖2；IKKβmRNA 在鼻咽癌中的相對表達(dá)量（1.1929±2.1870）與在鼻咽炎中的相對表達(dá)量（1.6007±0.4877）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 熒光定量擴增曲線圖

圖3 IKKβ mRNA 的相對表達(dá)量

2.4 IKKβ 蛋白的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系 在鼻咽癌中，IKKβ 蛋白的陽性表達(dá)率與鼻咽癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均有關(guān)（P＜0.05），腫瘤體積越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期越高的鼻咽癌IKKβ 蛋白的陽性表達(dá)率越高；但I(xiàn)KKβ 蛋白的陽性表達(dá)率與性別、年齡、組織學(xué)分型無關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 鼻咽癌組織IKKβ 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（n）

2.5 鼻咽癌組織中IKKβ mRNA 的相對表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系 RT-PCR 結(jié)果顯示，IKKβ mRNA 在T1～2鼻咽癌中的相對表達(dá)量高于T3～4鼻咽癌（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌IKKβ mRNA 相對表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的（P＜0.05）；鼻咽癌mRNA 在Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌組織中相對表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）；IKKβmRNA 的相對表達(dá)量與鼻咽癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、TNM 分期有關(guān)，而與患者年齡、性別、組織學(xué)分型無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3 鼻咽癌患者IKKβmRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[M（P25，P75）]

3 討論

以往研究表明，遺傳易感性、環(huán)境因素和EB 病毒（EBV）感染是鼻咽癌的三大致病因素。EBV 雖然普遍存在，但與鼻咽癌密切相關(guān)，在未分化型鼻咽癌中，幾乎100%的腫瘤病灶存在EBV 基因組[7]。由于診斷延遲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高、缺乏靶向藥物、臨床預(yù)后欠佳，越來越多的研究者致力于揭示鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，鼻咽癌信號通路的失調(diào)已經(jīng)被廣泛研究。NF-κB 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、代謝、血管生成、炎癥和細(xì)胞黏附/遷移的基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，多種炎癥性疾病和癌癥已顯示NF-κB 信號傳導(dǎo)失調(diào)導(dǎo)致該途徑激活，NF-κB 誘導(dǎo)炎癥的能力使其成為慢性炎癥與癌癥之間的關(guān)鍵聯(lián)系之一[8]。

NF-κB 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它是由Rel 家族成員組成的二聚體蛋白，即P50/p105（NF-κB1）、p52/p100（NF-κB2）、p65（RelA）、RelB 和c-Rel[9]。NF-κB 信號通路通常通過兩種主要途徑：經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典通路的激活發(fā)生在許多刺激的下游，包括促炎因子IL-6、TNF-α 和整合素1，這些刺激通過不同的機制來誘導(dǎo)NF-κB 激活，包括泛素聚合物和信號蛋白復(fù)合物的形成，如IKK（IB 激酶）復(fù)合物。IKK 復(fù)合物包含3 個亞基，包括IKKα、IKKβ 和調(diào)節(jié)蛋白NEMO（或IKKγ），正常情況下，三者以1∶1∶2 的比例組合在一起[10]。IKKβ 激活依賴于激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，IKKβ 激活可以進(jìn)一步磷酸化IκBα 并導(dǎo)致其降解，從而釋放NF-κB（p65/p50亞單位）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活其轉(zhuǎn)錄靶點[11]，包括參與細(xì)胞氧化還原代謝及其調(diào)節(jié)的基因，以及那些促進(jìn)癌細(xì)胞生存、增殖、上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移的基因[12]。NF-κB 通過影響具有癌癥特征的基因的異常調(diào)節(jié)，在各種癌癥中確立了促瘤作用。許多研究證實，通過基因消融或IKKβ 小分子抑制劑來抑制NF-κB 在體內(nèi)具有抗炎和/或抗腫瘤作用[13]。IKKβ 缺陷小鼠在胚胎發(fā)育第13 天死亡，這是由于在肝臟發(fā)育過程中NF-κB 的TNF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重的肝細(xì)胞凋亡而死亡[14]，這些結(jié)果表明IKKβ在NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用。

NF-κB 在乳腺、肺、膀胱和卵巢癌中過表達(dá)。多項研究表明，NF-κB 通路在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中過表達(dá)或激活[15]。NF-κB 信號系統(tǒng)可促成鼻咽癌的發(fā)生，其與EBV 感染和大量淋巴樣浸潤密切相關(guān)，潛伏膜蛋白1（LMP1）作為EBV 癌蛋白，是NF-κB信號傳導(dǎo)的有效激活劑[16]，LMP1 可磷酸化IKK 復(fù)合物并誘導(dǎo)IКBα 降解，從而導(dǎo)致NF-κB 活化，NF-κB 的過表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展[17]。Ki-67是一種僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)的核蛋白，因此Ki-67標(biāo)記指數(shù)反映了腫瘤細(xì)胞的增殖情況。研究證實，Ki-67 表達(dá)與乳腺癌和肺癌的侵襲性密切相關(guān)，而其他研究顯示Ki-67 在鼻咽癌表達(dá)較高，Ki-67 表達(dá)與鼻咽癌的分期和預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)測鼻咽癌局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有用指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果顯示，IKKβ 和Ki-67 蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)高于鼻咽炎組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IKKβ 和Ki-67 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示IKKβ 陽性表達(dá)的鼻咽癌增殖活性較高，預(yù)后較差；IKKβ 蛋白和mRNA 在不同腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期中的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在腫瘤較大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期較高的鼻咽癌組織中IKKβ 蛋白和mRNA 的表達(dá)越高，NF-κBp65 和IKKβmRNA 的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理諸因素的關(guān)系密切；提示IKKβ 表達(dá)越高的鼻咽癌增殖速度越快，侵襲性越強，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床分期越晚，預(yù)后越差。NF-κB 通路可能參與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展，IKKβ 過表達(dá)可能是判斷鼻咽癌患者預(yù)后的獨立因素。典型的NF-κB 通路對鼻咽癌的腫瘤發(fā)展和血管生成至關(guān)重要，提示NF-κB 通路可能是鼻咽癌潛在的治療靶點[19]。IKKβ 是IKK 復(fù)合物的一個催化亞基，被認(rèn)為是最有效和最具選擇性的藥物靶點之一，因為活化IKKβ 使IκB 磷酸化是IκBα 泛素化降解和NF-κB 釋放到核的前提條件[20]，通過抑制其活性，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥、提高抗腫瘤藥物的敏感性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡等作用，從而提高抗腫瘤治療的療效[21]。

綜上所述，IKKβ 與鼻咽癌的臨床病理特征有關(guān)，其過度表達(dá)與預(yù)后不良有密切關(guān)系，提示IKKβ可能參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程，IKKβ 高表達(dá)在鼻咽癌浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。