兩種分子藥物敏感性試驗與表型藥物敏感性試驗檢測結核分枝桿菌耐藥性的效能比較

孫雯娜 張俊仙 張秀爽 王曉朦 林文 梁艷 王杰 吳雪瓊

早診斷、早治療是預防和控制耐藥結核病傳播的重要手段[1]。目前，我國臨床常用的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法主要有兩種：表型藥敏試驗和分子藥敏試驗。表型藥敏試驗作為MTB耐藥性檢測的標準，可檢測多種一、二線抗結核藥物的敏感性及耐藥程度；而分子藥敏試驗可快速檢測MTB耐藥相關基因的突變，目前已在我國上市的主要有反向雜交技術、基因芯片法(簡稱“芯片法”)[2]、實時熒光定量PCR法(GeneXpert MTB/RIF)[3]、熒光定量PCR探針熔解曲線法(簡稱“熔解曲線法”)[4]，以及基因測序技術等[5]。筆者以表型藥敏試驗絕對濃度法檢測結果為標準，比較芯片法和熔解曲線法直接檢測臨床標本中MTB耐藥性的診斷效能，評價其臨床應用價值。

資料和方法

一、研究材料

選取中國人民解放軍總醫院第八醫學中心結核病醫學部結核科住院且確診為結核病的44例患者的臨床樣本。其中，痰標本29例，支氣管肺泡灌洗液13例，頸部淋巴結結核膿液標本1例，骨關節結核組織標本1例。每例樣本同時分為2份，1份進行傳統的分枝桿菌培養、菌種鑒定和表型藥敏試驗，另1份提取核酸后進行耐藥基因芯片檢測，以及熔解曲線法耐藥性檢測。

二、儀器與試劑

改良羅氏培養基、對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2羧酸肼(TCH)，以及表型藥敏試驗絕對濃度法利福平(RFP)、異煙肼(INH)、左氧氟沙星(Lfx)含藥培養基購自珠海銀科醫學工程股份有限公司；核酸提取試劑、晶芯ExtractorTM36 核酸快速提取儀、結核分枝桿菌耐藥基因芯片檢測試劑盒和晶芯微陣列芯片雜交掃描系統為博奧生物集團有限公司產品；MTB的RFP、INH和Lfx藥物熒光定量PCR探針熔解曲線法耐藥性檢測試劑盒、實時熒光定量PCR儀(SLAN-96S型)及熔解曲線分析軟件為廈門致善生物科技股份有限公司產品。

三、試驗方法

1. 分枝桿菌培養、菌種鑒定和表型藥敏試驗：對臨床標本進行處理后，接種于改良羅氏培養基，置37 ℃進行分枝桿菌培養。分枝桿菌培養陽性的分離株經PNB和TCH含藥培養基進行鑒別培養，鑒定為MTB后進行表型藥敏試驗絕對濃度法。以上實驗步驟按照《結核病實驗室檢驗規程》[6]進行。INH、RFP和Lfx等3種含藥培養基低、高濃度分別為(1，10) μg/ml、(50，250) μg/ml和(1，10) μg/ml，在對照培養基生長良好的前提下，低濃度含藥培養基上菌落數大于20個即判定為耐藥。

2. DNA制備：臨床標本經液化和洗滌處理后，采用晶芯ExtractorTM36 核酸快速提取儀和核酸提取試劑，按照說明書進行DNA提取，然后置于-20 ℃儲存備用。

3. 耐藥基因芯片檢測：將提取好的核酸應用結核分枝桿菌耐藥基因芯片檢測試劑盒，按照說明書進行RFP和INH耐藥基因檢測，將芯片載入晶芯微陣列芯片掃描儀自動判讀結果。該芯片檢測MTB的RFPrpoB基因6個位點、13種突變基因型；檢測MTB的INHkatG基因315位2種突變類型和inhA基因啟動子-15位C→T突變基因型。

4. 熔解曲線法耐藥性檢測：將提取好的核酸應用熒光定量PCR探針熔解曲線試劑盒，按照說明書進行MTB對RFP、INH和Lfx耐藥性檢測，該方法檢測MTB的RFPrpoB507～534核心區位點的突變情況；檢測MTB的INHkatG315密碼子、inhA94密碼子、inhA啟動子區(-17～8位點)以及ahpC啟動子區(-44～-30及-15～3位點)的突變情況；檢測MTB的LfxgyrA88～94位密碼子突變。

四、統計學處理

用SPSS 24.0軟件對數據進行統計學分析。以表型藥敏試驗絕對濃度法為標準，計算芯片法和熔解曲線法的敏感度、特異度、準確度和Kappa值。Kappa值介于0.41～0.60時為兩者之間有較好一致性，介于0.61～0.80時為高度一致；介于0.81～1.00時為完全一致。

結 果

一、絕對濃度法藥敏試驗

表型藥敏試驗絕對濃度法結果顯示，44株MTB臨床分離株中，RFP高水平耐藥14例，低水平耐藥2例，敏感28例；INH高水平耐藥3例，低水平耐藥11例，敏感30例；Lfx高水平耐藥17例，低水平耐藥3例，敏感24例。

二、芯片法耐藥性檢測

應用芯片法直接檢測44例臨床標本對MTB的耐藥性，結果顯示，RFP耐藥15例，其中531位密碼子TCG→TTG突變10例，526位密碼子 CAC→TAC突變1例，531位密碼子TCG→TGG突變1例，533位密碼子CTG→CCG突變1例，511位密碼子CTG→CCG突變1例，526位密碼子CAC→CGC突變1例；RFP敏感29例。INH耐藥13例，其中katG315位密碼子AGC→ACC突變9例，inhA-15堿基 C→T 突變3例，katG315位密碼子AGC→ACC 合并inhA-15堿基 C→T聯合突變 1例；INH敏感31例。

三、探針熔解曲線法耐藥性檢測

應用熔解曲線法直接檢測44例臨床標本中MTB的耐藥性，結果顯示，RFP耐藥17例，其中529～533位點突變12例，521～528位點突變1例，513～520位點突變1例，507～512、513～520、521～528多位點突變1例；檢測出耐藥但突變位點不明確2例；敏感27例。INH耐藥17例，katG315位點突變12例，inhA啟動子區突變3例，ahpC啟動子區突變1例，ahpC啟動子區合并inhA啟動子區突變1例；敏感27例。Lfx耐藥17例，均在gyrA基因88～94位密碼子區域，敏感27例。

四、三種藥敏試驗方法的比較

以絕對濃度法藥敏試驗檢測結果為標準，芯片法和熔解曲線法檢測RFP、INH和Lfx耐藥的敏感度、特異度、準確度和Kappa值見表1和表2，檢測結果見表3～5。

以芯片法和熔解曲線法檢測RFP的耐藥性，有6例結果不一致，符合率為86.4%(38/44)，4例為芯片法敏感、熔解曲線法耐藥，2例為芯片法耐藥、熔解曲線法敏感；在檢測INH耐藥性時，有4例結果不一致，符合率為90.9%(40/44)。

從表3可以看出，RFP耐藥大多數是高水平耐藥(87.5%，14/16)，而且主要位于531位密碼子(78.6%，11/14)和526位密碼子(7.1%，1/14)。表4顯示，INH耐藥大多數是低水平耐藥(78.6%，11/14)，主要位于katG315位密碼子(63.6%，7/11)，少數位于inhA-15位堿基(18.2%，2/11)。

本研究中共檢測出3例INH高水平耐藥，其中katG315位密碼子和inhA-15位堿基雙位點聯合突變1例，katG315位密碼子突變2例。

表1 以絕對濃度法藥敏試驗為標準判斷芯片法對結核分枝桿菌耐藥性檢測的效能

表2 以絕對濃度法藥敏試驗為標準判斷熔解曲線法對結核分枝桿菌耐藥性檢測的效能

表3 三種藥敏試驗方法檢測臨床標本中結核分枝桿菌對利福平的耐藥性 [突變情況(例)]

表4 三種藥敏試驗方法檢測臨床標本中結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性 [突變情況(例)]

表5 二種藥敏試驗方法檢測臨床標本中結核分枝桿菌對左氧氟沙星的耐藥性 [突變情況(例)]

討 論

我國是耐藥結核病高負擔國家之一。目前在我國臨床上應用的MTB分子藥敏診斷方法主要有GeneXpert MTB/RIF、芯片法和探針熔解曲線法。本研究以傳統的絕對濃度法藥敏試驗為對照，比較芯片法和探針熔解曲線法檢測MTB耐藥性的診斷效能。

一、診斷效能研究

本研究應用芯片法和探針熔解曲線法直接檢測臨床標本中MTB對RFP、INH和Lfx的耐藥性，敏感度均在85%以上，芯片法檢測RFP和INH的耐藥性均具有較高的特異度(96%)，與相關文獻報道相似[7-8]；而探針熔解曲線法檢測RFP和INH的特異度雖然均超過80%，低于目前大多數的文獻報道[7，9]，但是也基本能滿足臨床耐藥結核病快速診斷的需求。

二、芯片法和熔解曲線法不一致的原因

本研究結果顯示，芯片法和熔解曲線法檢測RFP的耐藥性，有6例結果不一致，符合率為86.4%；檢測INH耐藥性，有4例結果不一致，符合率為90.9%。芯片法和熔解曲線法檢測RFP和INH耐藥性的敏感度相同，但芯片法檢測的特異度和準確度均高于熔解曲線法。分析其原因可能是：(1)熔解曲線法較芯片法檢測覆蓋的突變位點更廣泛，用來檢測豐度低的異質性耐藥樣本時可能占有更多優勢，但某些與耐藥無關的密碼子(如507～509、517、523、532位)突變也能被檢出[10-11]；(2)本研究中兩種分子生物學方法均是直接檢測臨床樣本中提取的MTB DNA模板，可能受核酸提取方法、提取效率、DNA純度及標本中耐藥異質性、抑制因子的影響，導致與其他文獻報道的檢測分離株的分子藥敏試驗方法結果的差異；(3)本研究表型藥敏試驗使用的是絕對濃度法，與其他研究中使用的對照方法(如比例法藥敏試驗、BACTEC MGIT 960藥敏試驗)不同，在結果上可能存在一定的差異；(4)研究所納入的樣本類型不同，本研究的研究對象包括了肺結核和肺外結核患者的標本，而上述報道是以肺結核標本為研究材料，結果可能會存在一定差異；(5)由這些基因其他區域或其他耐藥相關基因引起的突變，以及其他耐藥機制引起的耐藥，應用這兩種分子藥敏試驗方法不能檢出，也可能是導致分子藥敏試驗敏感度低于表型藥敏試驗的原因[12]。

三、耐藥基因突變與耐藥水平的關系

從表2可以看出，RFP耐藥大多數是高水平耐藥(87.5%)，而且主要位于531位密碼子(78.6%)和526位密碼子(7.1%)，與目前研究結果一致，提示臨床結核病患者一旦出現RFP耐藥，大多數患者治療效果不佳，需停用利福霉素類藥物，更換有效的化療方案。表3顯示，INH耐藥大多數是低水平耐藥(78.6%)，主要位于katG315位密碼子(63.6%)，少數位于inhA-15位堿基(18.2%)，且這些低水平耐藥在傳統藥敏試驗方法中不易被檢出，通常表現為敏感；少數患者katG315位密碼子和inhA-15位堿基雙位點聯合突變會導致高水平耐藥，本研究中共檢測出3例INH高水平耐藥，其中katG315位密碼子和inhA-15位堿基雙位點聯合突變1例(1/3)，katG315位密碼子突變2例(2/3)，這些結果與劉銀萍等[13]的研究結果一致，與Rivière等[14]的結果不同，分析其原因如下：(1)katG315位密碼子突變只是導致過氧化氫酶和過氧化物酶活性降低，使INH轉換為異煙酸的能力降低[15-16]，不同菌株的最低抑菌濃度差異很大，因此，傳統藥敏試驗時可能表現為低、中、高水平耐藥或藥物敏感，使得不同研究報道的結果存在差異[17]。本研究使用絕對濃度法顯示的低水平耐藥，也有可能與絕對濃度法選取的臨界濃度較高有關[18]，提示臨床應根據藥物最低抑菌濃度結果決定調整INH的劑量或停用INH；(2)結核分枝桿菌inhA-15位堿基突變也通常導致INH低、中水平耐藥[13, 19]；(3)本研究選取的作為對照的表型藥敏試驗方法為絕對濃度法，僅選取2個藥物濃度作為對照，而Rivière等[14]參照的是藥物最低抑菌濃度法，具備多種濃度梯度的檢測結果，因此在耐藥程度的判斷上可能會有一定差異，造成研究結果的不一致。Lfx耐藥大多數是高水平耐藥(94.1%)，均由gyrA88～94位密碼子突變所致(100.0%)；這與文獻報道一致[20]。本研究中3例樣本Lfx表型藥敏試驗顯示耐藥，而分子藥敏試驗檢測為敏感，可能的原因是：(1)可能存在異質性耐藥，分子生物學方法通常只能檢測豐度高于20%的耐藥結核分枝桿菌，從而造成部分低豐度耐藥樣本漏檢；(2)熔解曲線法針對氟喹諾酮類藥物耐藥基因gyrA88～94密碼子的突變狀況進行檢測，由其他基因(如gyrB)或gyrA基因其他區域引起的突變，以及其他氟喹諾酮類藥物耐藥機制引起的耐藥，本試驗不能檢出。

本次研究所選取的作為對比的傳統藥敏試驗方法為絕對濃度法，與標準方法——比例法結果可能存有一定差異。此外，本研究只檢測了44例患者的樣本，樣本量偏少，且未對不一致樣本使用測序方法進行驗證，因此也存在一定的局限性。

總之，傳統的絕對濃度法藥敏試驗可檢出多種藥物不同程度的耐藥情況，但需較長的時間，不能滿足臨床早期診斷的需求；芯片法在檢測RFP和INH時具有較高的特異度和一致性，熔解曲線法在檢測Lfx耐藥性時表現出了較好的效能，且操作更為簡便和快速。兩種分子藥敏試驗方法均可早期、快速檢出耐藥MTB，指導臨床合理用藥和開展有效治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻孫雯娜和張俊仙：醞釀和設計實驗，論文撰寫和修改；張秀爽、王曉朦和林文：實施研究并收集整理數據；梁艷：行政、技術支持；王杰：數據錄入；吳雪瓊：獲取研究經費，技術和材料支持，文章修改和指導