魚腥草黃酮類化合物提取、純化及抗氧化研究

魚腥草又名折耳根，學名為蕺菜，主要分布于中國、韓國、日本和東南亞等地區，資源非常豐富，是一種藥食同源的食物，常作為食材或者藥材應用，在西南地區被人們廣泛食用。例如，魚腥草是西南地區的首席涼拌菜，還可以用作炒菜的原材料，深受人們喜愛[1]。同時，在中醫治療方面，可以將魚腥草曬干煮水喝或泡茶喝，具有清熱解毒、祛痰止咳、鎮痛止血等功效，用于治療肺炎、支氣管炎和慢性阻塞性呼吸道疾病[2]。根據目前研究，魚腥草中含有豐富的活性成分，如揮發油、黃酮類化合物和有機酸等，其中黃酮類化合物最為豐富[3]。研究表明，黃酮類化合物具有較好的生物活性，如抗氧化、抗癌、抗腫瘤、降血壓和預防心血管疾病等功能活性[4]。因此，研究魚腥草黃酮的提取及抗氧化活性研究具有重要的實際意義。

目前，有關魚腥草的研究大多集中于黃酮的提取，提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取及雙水相提取法等，而對于魚腥草黃酮的純化及抗氧化活性研究較少[1]。其中，超聲波輔助提取法主要是利用超聲波在介質中的機械振動及空化作用，提高黃酮的溶出效率[5]。一般，黃酮類化合物的抗氧化性主要體現在供氫能力，其結構中的羥基和羰基可通過阻止自由基產生來發揮抗氧化作用。因此，本研究采用超聲波輔助法提取魚腥草中的黃酮，通過正交試驗優化黃酮的提取條件，利用大孔樹脂D101對提取的黃酮進行粗純化，并對比純化前后的抗氧化活性，旨在為開發魚腥草資源利用及新型保健食品、化妝用品、藥品提供一定的理論科學依據，具有重要的社會效益和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

魚腥草干制品，經60 °C烘干，磨碎，過60目篩備用；蘆丁，維克生物科技有限公司；D101大孔樹脂，東鴻化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）與2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），合肥巴斯夫科技有限公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉和過硫酸鉀（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為去離子水（實驗室自制）。

WF-18超微粉碎機，溫州頂歷醫療器械有限公司；KS-600D超聲波儀器，寧波海曙科生超聲設備有限公司；TDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠；FA2104B電子天平，上海市安亭電子儀器廠；V-1000分光光度計，翱藝儀器有限公司；THZ-100恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定吸光度[6]。分別精密吸取蘆丁對照液（0.2 mg·mL-1） 0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分別放入50 mL的容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3 mL，充分搖晃后等待反應6 min，滴加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液進行搖晃后，等待反應6 min，加4.00 mL 4% NaOH溶液反應10 min，最后用70%乙醇定容，設空白對照，于510 nm處測吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線y=0.010 8x+0.013 7，R2=0.999 7。

1.2.2 超聲波輔助提取魚腥草黃酮

準確稱取一定量的魚腥草粉末樣品，加入一定比例的乙醇溶液，然后利用超聲波提取一定時間，將提取液離心（4 000 r·min-1，10 min）后定容，作為待測液。

1.2.3 單因素試驗

（1）乙醇濃度對魚腥草黃酮提取率的影響。在料液比1∶20，超聲時間60 min的條件下，研究乙醇濃度為30%、40%、50%、60%和70%對魚腥草黃酮提取率的影響。

（2）料液比（m∶V）對魚腥草黃酮提取率的影響。在乙醇濃度50%，超聲時間60 min條件下，研究不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50對魚腥草黃酮提取率的影響。

（3）提取時間對魚腥草黃酮提取率的影響。在料液比為1∶40，乙醇濃度50%的條件下，分別研究超聲提取時間30 min、40 min、50 min、60 min和70 min對魚腥草黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗

在得出3個因素最優提取水平條件下，采用L9(34)正交試驗設計對魚腥草黃酮類化合物的提取工藝進行優化。

1.2.5 大孔樹脂純化

（1）樹脂的預處理。樹脂用無水乙醇浸泡24 h，用水清洗至無刺激性氣味，在5% HCl溶液浸泡2 h后用水洗至中性，2% NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性備用。

（2）靜態吸附解吸試驗。在100 mL具塞磨口三角瓶中加入5 g處理活化后的樹脂，加入50 mL魚腥草粗提液，塞上磨口玻璃塞后在25 ℃條件下振蕩吸附20 h，取吸附上清液測黃酮濃度，計算比吸附量（式1）。然后用水清洗吸附樹脂表面雜質，以50%的乙醇為洗脫液，25 ℃條件下恒溫振蕩解吸20 h，取解吸上清液測黃酮濃度，計算解析率（式2）及純度（式3）。

式中：C0為粗提液濃度，mg·mL-1；V0為粗提液體積，mL；C1為提純后濃度，mg·mL-1；V1提純后體積，mL；M為樹脂質量，g。

式中：C2為洗脫液黃酮濃度，mg·mL-1；V2為洗脫液體積，mL；Q為比吸附量，mg·g-1；M為樹脂質量，g。

純度=凍干復溶液中黃酮的含量/復溶前凍干樣

1.2.6 魚腥草黃酮抗氧化活性的測定

（1）DPPH自由基清除率的測定。將純化前后的魚腥草黃酮樣品稀釋至不同的濃度，分別為0.500 00 mg·mL-1、0.250 00 mg·mL-1、0.125 00 mg·mL-1、0.062 50 mg·mL-1和0.031 25 mg·mL-1，同時設置樣品空白組（不加提取液，利用提取溶劑代替）。按照JORAHOLMEN等[7]的方法測定DPPH自由基的清除能力。清除率計算公式為

式中：A0為無水乙醇與DPPH反應后的吸光值；A1為樣液與DPPH反應后的吸光值；A2為樣液與無水乙醇反應后的吸光值。

（2）ABTS自由基清除率的測定。樣品處理同上，取0.2 mL提取液和2.0 mL ABTS+（7.4 mmol·L-1）反應液室溫避光反應6 min。同時，設置空白對照組A0，在734 nm下測定其吸光值，用抗壞血酸進行陽性對照試驗，具體詳細操作同上。ABTS自由基清除率計算公式為

式中：A0為（0.2 mL）無水乙醇+（2 mL） ABTS溶液的吸光值；As為（0.2 mL）樣品溶液+（2 mL）ABTS溶液的吸光值；Ac為（0.2 mL）樣品溶液+（2 mL）無水乙醇的吸光值。

1.3 數據處理

試驗均重復3次，數據以平均值±標準差表示，利用SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對魚腥草黃酮提取率的影響

由圖1可知，魚腥草黃酮提取率隨乙醇濃度的增大呈先升高后降低的趨勢。當乙醇濃度達到50%時，黃酮提取率最高。這是因為在一定乙醇濃度范圍內，黃酮的溶出率逐漸提高，但當乙醇濃度超過50%時，魚腥草中的其他脂溶性成分也會溶出，影響黃酮的提取，導致黃酮的提取率降低。因此，乙醇濃度選擇50%。

圖1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響圖

2.1.2 料液比對魚腥草黃酮提取率的影響

由圖2可知，魚腥草黃酮的提取率隨提取液比例的增大逐漸提高，當料液比降低至1∶40以下時，黃酮提取率增加幅度較為減緩。這是因為在一定料液比范圍內，隨提取液比例的增大，物料與溶劑的接觸面積增大，黃酮的溶出率增大，而當料液比降低至1∶40以下時，料液比對黃酮的溶出效率沒有明顯影響，而且過度增加溶劑添加量，會提高成本。綜合考慮，選擇料液比為1∶40。

圖2 料液比對黃酮提取率的影響圖

2.1.3 超聲時間對魚腥草總黃酮提取率的影響

由圖3可知，在一定時間范圍內，魚腥草黃酮提取率隨超聲時間的延長逐漸升高，而當超聲時間超過50 min后，魚腥草黃酮的提取率顯著降低。這是因為在一定時間內，隨超聲時間的延長，魚腥草溶質分子運動加快，增大了黃酮的溶出速率，但當超聲時間過長，會破壞魚腥草黃酮的結構，導致提取率降低。因此，超聲時間選擇50 min。

圖3 超聲時間對黃酮提取率的影響圖

2.2 正交試驗

由表1可知，RB＞RA＞RC，即料液比是黃酮提取率最大的影響因素，其次是乙醇濃度與超聲時間。同時，根據K值大小得到黃酮最佳提取工藝條件為A1B3C3組合，即乙醇濃度為40%、料液比為1∶50、超聲時間為60 min，此時黃酮的提取率為4.764%。

表1 正交試驗設計及結果表

2.3 黃酮的粗純化

將魚腥草黃酮粗提物在D101大孔樹脂振蕩吸附20 h后，測得吸附后黃酮濃度為2.606 mg·mL-1，經計算得出比吸附容量為5.27 mg·g-1，利用50%濃度乙醇水溶液對魚腥草黃酮物質解吸，解吸率為94.87%。純化前后提取液經過旋轉蒸發除去乙醇凍干復溶后，最終測得黃酮的純度提高了2.59倍。

2.4 純化前后魚腥草黃酮的體外抗氧化活性的測定

由圖4可知，魚腥草黃酮和維生素C對ABTS自由基的清除能力隨其濃度的增大逐漸升高，當濃度升高至0.125 00 mg·mL-1后，對ABTS的清除能力趨于平緩。與未純化黃酮相比，尤其在低黃酮濃度條件下，黃酮經純化后對ABTS的清除率顯著提高，當黃酮濃度為0.500 00 mg·mL-1時，未純化黃酮對ABTS自由基的清除能力為94.54%，黃酮提純后的清除能力高達97.93%，純化后對ABTS自由基的清除能力顯著提高，說明黃酮經純化后其抗氧化活性提高。

圖4 純化前后魚腥草黃酮對ABTS自由基清除能力的影響圖

由圖5可知，魚腥草黃酮和維生素C對DPPH自由基的清除能力隨其濃度的增大逐漸增強，而當濃度增大至0.125 00 mg·mL-1后，樣品對DPPH的清除能力趨于平緩。維生素C的抗氧化能力顯著高于魚腥草黃酮。在濃度低于0.125 00 mg·mL-1時，與未純化黃酮相比，純化后的黃酮對DPPH自由基的清除能力顯著提高，即低濃度下，黃酮純度越高，其抗氧化活性越強。這是因為未純化的黃酮提取液含有較多的雜質，與黃酮之間發生相互作用形成復合物，影響了黃酮提供氫的能力，導致抗氧化活性減弱，而純化后的黃酮，純度相對提高，可以增強黃酮對DPPH自由基的清除能力，說明純化對黃酮類化合物的應用具有重要的意義。

圖5 純化前后魚腥草黃酮對DPPH自由基清除能力的影響圖

3 結論

本文主要通過超聲波輔助法提取魚腥草中的黃酮類化合物，對黃酮進行粗純化，并通過DPPH和ABTS自由基的清除能力研究黃酮的抗氧化活性。研究表明魚腥草黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度40%、料液比1∶50、超聲時間60 min，此時黃酮的提取率為4.764%。經D101型大孔樹脂粗純化后，純度提高了2.59倍，經純化處理后，黃酮的體外抗氧化活性顯著提高，且與濃度呈一定的相關關系。該研究為魚腥草的開發利用及功能食品的開發提供了理論基礎。