山楂提取物與抗生素復(fù)配的抑菌作用研究

山楂屬薔薇科的一種，其果實(shí)具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，還具有健脾消食、降血壓血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效[1]。山楂中含有多種活性物質(zhì)，其提取物安全無毒且含有一定的營養(yǎng)成分，可用于食品著色和飲料的配制等[2-3]。對(duì)于山楂提取物的抗菌作用，已有部分研究成果。姜珂等[4]研究了山楂提取物與β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑菌效果，呂曉楠等[5]研究了乳酸鏈球菌素（Nisin）與山楂提取液的復(fù)合抗菌效果。目前，關(guān)于山楂提取物與藥物復(fù)配后抗菌作用的研究相對(duì)較少。本研究采用一定的工藝提取山楂中的抑菌物質(zhì)，將其與抗生素復(fù)配后研究其協(xié)同抑菌性能，以期為山楂的綜合利用提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山楂：購自青島膠州市展記炒貨；大腸桿菌、變形桿菌：青島工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；阿莫西林分散片：中諾藥業(yè)；氯霉素片：廣東華南藥業(yè)集團(tuán)；克拉霉素分散片：成都恒瑞制藥。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，聯(lián)鯨電子科技有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面超凈工作臺(tái)，智誠科技有限公司；HJPS-250型恒溫培養(yǎng)箱，智誠科技有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；GM-B2002電子天平，南京伯尼塔科學(xué)儀器有限公司；SE-750高速粉碎機(jī)，永康市圣象電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山楂活性物質(zhì)的提取

用自來水沖洗山楂，去籽，陰干，置于烘箱干燥后，粉碎、過篩，取40目的山楂粉，避光保存于磨口瓶中，備用。稱取原料粉末10 g，用70%的乙醇作萃取劑，按照20∶1的比例（70%乙醇∶原料粉末，mL∶g）加入。采用70 ℃超聲波萃取40 min后，進(jìn)行真空抽濾，回收濾液，在同樣的條件下，再萃取濾渣3次，將濾液進(jìn)行混合后旋蒸至10 mL，得到濃度為1 g·mL-1的山楂提取物。

1.3.2 抗生素與山楂提取物的復(fù)配方案

稱取克拉霉素、氯霉素粉末各100 mg，添加20 mL的蒸餾水進(jìn)行溶解，使其溶液達(dá)到5 000 μg·mL-1，儲(chǔ)存溫度以4 ℃為最佳。將配制好的抗生素溶液與山楂提取物按1∶0、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7比例復(fù)配，測(cè)定復(fù)配液對(duì)大腸桿菌、變形桿菌的抑菌效果。

1.3.3 菌懸液的制備

菌種活化后，將菌種接種于牛肉膏液體培養(yǎng)液中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)并稀釋菌液濃度至1×107CFU·mL-1。

1.3.4 抑菌圈的測(cè)定

向平板中加入0.1 mL的大腸桿菌和變形桿菌的菌懸液，將其均勻涂布，再將6 mm直徑的滅菌濾紙片浸入復(fù)配溶液0.5 h，然后粘貼于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿3片，濾紙片等間距排列，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行24 h的培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈的直徑大小，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂提取物的抑菌作用

由圖1可知，1 g·mL-1山楂提取物對(duì)大腸桿菌、變形桿菌都有一定程度的抑制效果，且對(duì)變形桿菌的抑制較為明顯，達(dá)到了9.8 mm。20世紀(jì)50年代，人們開始對(duì)山楂的化學(xué)成分進(jìn)行研究，證實(shí)其含有大量的黃酮以及有機(jī)酸、金絲桃甙、膽堿、維生素C等成分[1]。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是山楂提取物中含有的復(fù)雜活性成分對(duì)大腸桿菌及變形桿菌的生長產(chǎn)生了抑制作用。

圖1 山楂提取物的抑菌作用圖

2.2 克拉霉素復(fù)配液對(duì)變形桿菌的抑菌作用

由圖2可知，克拉霉素和山楂提取物復(fù)配可以增強(qiáng)對(duì)變形桿菌的抑菌作用，最佳復(fù)配比例為1∶5，此時(shí)抑菌圈直徑為13.7 mm。繼續(xù)增加山楂提取物用量，復(fù)配物效價(jià)下降，可能是提取物中過多的復(fù)雜成分與克拉霉素產(chǎn)生了拮抗作用，也可能是山楂提取物偏酸性，隨著山楂提取物比例增加，復(fù)配液的pH值減小，減弱了克拉霉素的抑菌活性。

圖2 克拉霉素復(fù)配液對(duì)變形桿菌抑菌作用圖

2.3 克拉霉素復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

由圖3可知，當(dāng)復(fù)配比例為1∶0到1∶5時(shí)，抑菌圈的直徑逐漸增大，說明克拉霉素和山楂提取物復(fù)配可以增強(qiáng)對(duì)大腸桿菌的抑菌作用，復(fù)配比例為1∶5時(shí)抑菌效果最好，抑菌圈直徑為13.0 mm。克拉霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其抑菌機(jī)理是通過與細(xì)胞核糖體50S亞基結(jié)合，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，具有較強(qiáng)的抑菌能力。繼續(xù)增加山楂提取物用量，復(fù)配物的效價(jià)降低，其原因可能是提取物中的多種組分與克拉霉素有一定的拮抗性，或者是pH值減小影響了克拉霉素的抑菌效果。

圖3 克拉霉素復(fù)配液對(duì)大腸桿菌抑菌作用圖

2.4 氯霉素復(fù)配液對(duì)變形桿菌的抑菌作用

由圖4可知，氯霉素和山楂提取物復(fù)配明顯地增強(qiáng)了對(duì)變形桿菌的抑菌作用，且復(fù)配比例為1∶4時(shí)，抑菌效果最好，抑菌圈直徑為28.8 mm，為單獨(dú)使用氯霉素時(shí)的1.72倍。有學(xué)者研究顯示氯霉素與維生素C合用會(huì)導(dǎo)致抗菌藥物的抗菌活性顯著下降[6]，本實(shí)驗(yàn)中克拉霉素復(fù)配液在1∶5時(shí)抑菌效果最好，而氯霉素則是在復(fù)配比為1∶4時(shí)抑菌效果較好，推測(cè)其原因可能是山楂提取物中含有豐富的維生素C，復(fù)配比為1∶5時(shí)，維生素C對(duì)抗菌活性的影響超過了氯霉素與提取物中其他活性物質(zhì)復(fù)配時(shí)的協(xié)同抑菌作用。

圖4 氯霉素復(fù)配液對(duì)變形桿菌抑菌作用圖

2.5 氯霉素復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

由圖5可知，氯霉素和山楂提取物復(fù)配增強(qiáng)了對(duì)大腸桿菌的抑菌作用，當(dāng)復(fù)配比例為1∶4時(shí)，抑菌效果最好，抑菌圈直徑為19.2 mm。氯霉素的抗菌機(jī)理是通過抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成，屬抑菌性廣譜抗生素，所以無論是變形桿菌還是大腸桿菌，其抑菌圈直徑都較大，抑菌作用較強(qiáng)。

圖5 氯霉素復(fù)配液對(duì)大腸桿菌抑菌作用圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選用山楂作為主要原料，經(jīng)過烘干、粉碎等處理之后，再經(jīng)超聲波提取、真空抽濾等措施獲得山楂提取物，并將山楂提取液與抗生素通過不同比例進(jìn)行復(fù)配，通過測(cè)定抑菌圈直徑大小，對(duì)其抑菌效果進(jìn)行研究，以此來確定最佳復(fù)配比例。試驗(yàn)結(jié)果表明，克拉霉素復(fù)配液的復(fù)配比例在1∶5時(shí)對(duì)供試菌的抑菌效果最好，而氯霉素復(fù)配液復(fù)配比例在1∶4時(shí)對(duì)供試菌的抑菌效果最好。山楂提取物與氯霉素復(fù)配時(shí)協(xié)同增效抑菌效果較好，其次是克拉霉素。當(dāng)超過一定復(fù)配比例時(shí)，山楂提取物和抗生素復(fù)配液的抑菌效果均會(huì)有所下降。