顯微共焦拉曼光譜技術在復雜未知物測定上的應用

隨著對食品、化工、生物和環境等領域研究的不斷深入，需要分析的研究對象呈現出多樣性和復雜性，因此關于未知物質的測定和分析問題備受關注。光譜分析技術是現代分析技術的重要組成部分，光譜分析技術一般包括發射光譜法、吸收光譜法和散射光譜法。當一束光照射在樣品上時，一般會發生反射、透射和散射。當散射光頻率和入射光頻率相同時為瑞利散射，還有一小部分（通常約為千萬分之一）散射光頻率發生變化，這部分散射光稱為拉曼散射。拉曼散射效應是由印度物理學家拉曼（C.V.Raman）于1928年發現并予以證實，拉曼利用汞弧燈光照射液體苯并觀察其散射光時，發現了光的非彈性散射現象。為紀念他的貢獻，人們以其名字命名為拉曼散射。光在與樣品材料的振動過程中發生了能量交換，拉曼光譜通過峰的位置、強度和形狀，反映出分子的振動或轉動頻率，從而得到樣品物質的化學和結構方面的信息。拉曼光譜作為一種可以對物質結構和成分進行“指紋”識別的光譜技術，具有分辨率高、鑒別力強等特點，使得拉曼光譜成為探測樣品振動的有力工具。目前，拉曼光譜技術已被廣泛應用于分子結構的研究及物質的鑒定[1-4]。

隨著拉曼光譜技術的不斷發展，人們開發出了一些新的拉曼光譜技術，如表面增強拉曼光譜技術（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）、共焦顯微拉曼光譜技術（Confocal Micrographic Raman Spectroscopy，CMRS）、共振拉曼光譜技術（Resonance Raman Spectroscopy，RRS）和傅立葉轉換拉曼光譜技 術（Fourier Transform Raman Spectroscopy，FT-Raman）。1990年G.J.Puppels等在Nature雜志上報道其發明的激光共焦拉曼光譜顯微技術，是拉曼技術的一次革命性的突破。共焦拉曼光譜技術是將拉曼光譜技術和顯微分析技術結合起來的一種應用技術，顯微共焦拉曼光譜儀將拉曼光譜儀和光學顯微鏡耦合在一起，通過不同倍數物鏡觀察樣品的形貌特征，并通過共焦針孔實現空間濾波功能，將激光光斑聚焦在樣品上進行拉曼測量，該方法具有高靈敏度和高分辨率的優點[5]。目前已成為食品[6]、制藥[7]、材料[8]、環境監測[9]、半導體[10]、司法刑偵[11]和珠寶鑒定[12]等分析領域的重要觀測手段之一。本文利用顯微共焦拉曼光譜技術，對葡萄糖發酵后的兩種復雜未知產物進行檢測，探討檢測未知物質的方法，擬為復雜未知物質的鑒定提出一種檢測思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

inVia? Reflex顯微共焦拉曼光譜儀，英國雷尼紹公司，儀器參數：激發光源波長532 nm和785 nm，掃描范圍100～4 000 cm-1，分辨率1 cm-1。

1.2 試驗方法

取適量待測樣品放置在載玻片上，壓實后置于顯微鏡載物臺上，選取5X和長焦50X物鏡鏡頭觀察樣品形貌，選擇合適測試區域，聚焦后進行拉曼光譜的采集。因待測樣品為未知物質，分別用532 nm和785 nm激光器激發拉曼光譜，用不同激光功率和采集時間確定最佳試驗參數。檢測過程中，從小到大逐漸嘗試最適宜的激光功率。本文建立的檢測條件如表1所示。

表1 樣品檢測條件表

1.3 試驗樣品

兩種待測樣品為未知葡萄糖發酵產物，分別命名為樣品A和樣品B。如圖1所示，兩種待測樣品均為粉末狀固體，樣品A（圖左上）呈現紅棕色，樣品B（圖右上）呈現灰白色。中間左圖為樣品A在5X鏡頭下形貌，中間右圖為樣品B在5X鏡頭下樣品形貌。圖左下為樣品A在長焦50X鏡頭下形貌，圖右下為樣品B在長焦50X鏡頭下形貌。

圖1 顯微鏡鏡頭下樣品形貌圖

續表1

2 結果與分析

圖2（a）為樣品A在532 nm激光器條件下的拉曼譜圖，在不同功率激光照射、不同采集時間條件下均得到類似譜圖。由圖可知，樣品A在激光激發下產生強熒光，熒光背景太強使探測器飽和，熒光信號湮沒了拉曼信號，CCD探測器探測不到拉曼信號。圖2（b）為樣品A在785 nm激光器條件下的譜圖，對比圖2（a）結果發現，得到的譜圖與532 nm激光器激發的結果類似，熒光背景太強，CCD探測器飽和，無法探測到拉曼信號。當試驗條件為532 nm激光器、激光功率25 mW和785 nm激光器、激光功率125 mW時，樣品被激光燒壞。

圖2 樣品A拉曼光譜圖

圖3（a）為樣品B在532 nm激光器照射、激光功率0.05 mW條件下的拉曼譜圖，圖3（b）為將激光功率增大后得到的樣品B的拉曼譜圖。由圖可知，樣品B在弱激光功率激光照射下，熒光強度高，無特征峰出現，增大激光功率后仍產生強熒光，CCD探測器飽和，探測器探測不到拉曼信號。圖4為樣品B在785 nm激光器照射下的譜圖，在不同功率激光照射、不同采集時間條件下均得到類似譜圖。試驗結果與532 nm激光器激發的結果類似，熒光背景太強，且無特征峰出現。

圖3 樣品B在532 nm激光器條件下拉曼光譜圖

圖4 樣品B在785 nm激光器條件下拉曼光譜圖

通過強激光長時間照射漂白，持續照射樣品1 min以上，利用物質的“熒光褪色效應”消除熒光干擾。通過試驗發現，樣品A和樣品B在強激光照射下被燒壞，如圖5（a）和5（b）所示，表明均不適用利用“光漂白”現象來減小熒光干擾。

圖5 樣品被燒壞圖

綜合分析結果可知，樣品A和樣品B在不同功率的激光激發下均產生了強熒光，掩蓋了拉曼信號，并且不適用通過強激光長時間照射來消除熒光背景。后續試驗可嘗試通過進一步純化樣品、加入熒光猝滅劑、改變激光器光源等方式減弱或消除熒光對樣品拉曼光譜的干擾。

3 結論

復雜未知物的測定是食品分析檢測領域的熱點和難點之一，其中往往含有非常豐富的化學組分，給拉曼光譜的解析帶來了困難。目前很多研究人員將拉曼光譜技術與其他技術聯用，以期彌補拉曼光譜技術在應用過程中的缺陷，提高檢測的靈敏度和表征的完整性。

熒光是一種光致發光現象，普遍存在于拉曼光譜采集過程中，拉曼光和熒光都是在激光激發下產生的，有效消除熒光背景的影響，得到準確、可靠的拉曼譜圖，是進行拉曼光譜采集的關鍵問題。部分物質的拉曼光譜熒光背景較強，可通過更改激光波長、純化樣品、加入熒光猝滅劑等方式減弱熒光對拉曼光譜的影響。需要注意的是，在檢測過程中要合理控制激光功率，從弱到強選擇出最適宜的激光功率，避免激光對樣品產生不可逆的損害。由于樣品物質的復雜性，本研究未能對樣品進行純化，以及因激光器波長的局限性未能找到合適的消除熒光干擾的方法，這也是今后對未知物測定開展進一步研究的方向。針對復雜未知樣品的測定，通過合適的方式消除熒光背景的干擾，拉曼光譜技術仍是解決復雜未知樣品結構分析的有力工具。