魚類肌肉生長抑制素myostatin研究進展*

楊慧榮，曾澤乾，楊炎，何穎琳，王慶，趙會宏，張勇，林浩然

1. 華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，廣東 廣州 510640

2. 華南農(nóng)業(yè)大學中山創(chuàng)新中心，廣東 中山 528400

3. 中山大學水生經(jīng)濟動物研究所/廣東省水生經(jīng)濟動物良種繁育重點實驗室，廣東 廣州 510275

脊椎動物肌肉組織的生長發(fā)育主要與肌源調(diào)控因子（mrfs）形成家族成員有關(guān)，包括myod、myf5、mrf4、myogenin［1］。在低等脊椎動物中，myod和myf5的初始表達一般與肌肉分化過程的前體期相關(guān)，而myogenin和mrf4的表達與成肌細胞分化的初始階段相關(guān)［2］。同時，這些動物體的肌肉組織也受到一些因子的負向調(diào)控，共同決定肌肉組織的生長發(fā)育。如TGF-β 超家族成員gdf-8，即肌肉生長抑制素Mstn［3］。以McPherron 為代表的學者首先從小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)mstn，在敲除mstn后發(fā)現(xiàn)由于肌細胞增生和肥大，導致骨骼肌的生長得到了顯著的提高［4］。此外，也有學者發(fā)現(xiàn)mstn喪失其抑制功能后可使得牛、豬、羊等脊椎動物的骨骼肌顯著增生，產(chǎn)生“雙肌”表型［5］。

已有研究表明，在大部分家畜動物中，mstn主要在骨骼肌大量表達，通過負向調(diào)控肌肉組織的生長，參與機體的生長發(fā)育和代謝過程。通過對不同物種Mstn 的遺傳結(jié)構(gòu)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)其在物種之間非常相似且保守，僅存在極少數(shù)的氨基酸變異，斑馬魚（Danio rerio）Mstn與一些家畜動物如牛和羊的Mstn 相比具有88%的同源性［6］。魚類作為人類重要的蛋白源，其Mstn 的研究也變得十分活躍。許多學者對魚類mstn的結(jié)構(gòu)、表達與功能開展了大量的研究，并取得了顯著的成果。鑒于此，本文系統(tǒng)綜述了近年來魚類肌肉生長抑制素的研究進展，明確下一步的研究方向，為水產(chǎn)養(yǎng)殖與水產(chǎn)遺傳育種的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 mstn的結(jié)構(gòu)與表達特征

與哺乳動物相同的是，魚類mstn的結(jié)構(gòu)也包含3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，兩者邊界均符合GT-AG規(guī)則［7］。在產(chǎn)生作用前，mstn會先合成由信號肽、N-末端區(qū)和C-末端區(qū)共3部分組成的前體蛋白，該蛋白存在一個位于兩個末端區(qū)之間的蛋白酶水解位點［8］。N-末端區(qū)能編碼前肽，同時存在1個由疏水性氨基酸殘基組成的信號肽，該信號肽能協(xié)助Mstn 前體蛋白在核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間進行轉(zhuǎn)運；C-末端區(qū)能編碼成熟肽，另外具有一個由9個半胱氨酸組成的節(jié)點［9］。信號肽的存在，可使Mstn 前體蛋白在細胞膜系統(tǒng)內(nèi)進行轉(zhuǎn)運，該蛋白還能通過活化、去除信號肽以及蛋白酶切割位點的切割，形成N 端-前肽和C 端-多肽兩部分。后者通過二硫鍵進行結(jié)合，最終形成活性蛋白。該活性蛋白在分泌至胞外后經(jīng)酶加工，位于成熟區(qū)的2個C-端單體在成熟蛋白與細胞膜上的受體作用下發(fā)揮功能，成熟蛋白進入血液循環(huán)，并與N-端信號肽結(jié)合，作用于靶基因調(diào)控骨骼肌的生成［10-11］。

在現(xiàn)有魚類中，mstn的研究包括斑馬魚等多種魚類（見表1），其mstn得到克隆或部分克隆。與哺乳動物不同的是，部分魚類由于發(fā)生基因組倍增，存在2 種mstn基因（mstn-1和mstn-2）并具有較高的同源性，如美洲紅點鮭（Salvelinus fontinalis）兩種mstn的同源性為92%［12］。部分鮭科魚類存在4 種mstn基因，其中第一進化分枝包括mstn-1a和mstn-1b， 第 二 進 化 分 枝 則 包 括mstn-2a和mstn-2b［13］。

哺乳動物mstn在除肌肉以外的其他組織中均弱表達甚至不表達，而魚類mstn在這些組織中存在不同程度的表達，且表達的部位可能受種類影響［6，14-23］。如表1 所示，鯉mstn僅存在于肌肉和腦中［16］。而花鱸在肌肉、眼睛和腦組織中檢測到mstn的高表達，在腎、心臟、脾、鰓的表達相對較少［17］。魚類mstn的時空表達特征可能存在種屬特異性，但目前可以確定的是mstn-1的表達相對較為廣泛，這兩種基因型不同的mstn存在組織特異性的可能性［24］。有學者對斑馬魚兩種mstn的差異進行分析，發(fā)現(xiàn)mstn-1在斑馬魚的整個胚胎發(fā)生過程均有表達，mstn-2的表達僅限于體節(jié)形成的初期［25］。

表1 部分魚類mstn基因Table 1 The myostatin genes of some fishes

在動物體胚胎時期至老年時期中，mstn的表達量大體上呈現(xiàn)一種先升后降再升高的規(guī)律［26］。所以，基于同種魚類來說，mstn的表達量可能與魚體生長發(fā)育的時期存在聯(lián)系，如淇河鯽（Carassius auratus）處于卵巢發(fā)育早期時mstn-2的表達量比mstn-1高，而在孵化后150～210 d 內(nèi)后者表達量相對較高。有趣的是，在其體細胞和成魚顆粒細胞中均發(fā)現(xiàn)Mstn蛋白，該蛋白通過促進cyp19a1的合成對卵巢的生長發(fā)育造成影響［27］。此外，mstn在部分魚類中具有性別二型性，如表1鮈鯽mstn在雄魚的肌肉、眼、大腦、腸和睪丸，雌魚的鰓、眼、腸和卵巢中大量表達，而在雄魚的心臟、鰓和膀胱，雌魚的肌肉、心臟、大腦和膀胱中mstn低表達［23］。

總體來說，魚類Mstn 與哺乳動物Mstn 存在不同的時空表達特征，骨骼肌并不是魚類Mstn 的唯一來源。從表達特征可知魚類Mstn 除調(diào)控肌肉組織生長外，還存在調(diào)控腦、性腺等組織器官的發(fā)育的可能性。魚類兩種Mstn 在生物學功能上具體存在哪一些差異，還有待進一步研究。

2 mstn的表達調(diào)控

在肌肉生長發(fā)育過程中，mstn參與類似E-box和mrfs等因子的轉(zhuǎn)譯調(diào)控。Rios 等［28］發(fā)現(xiàn)mstn的過度表達可降低myod和myog的表達水平，還能抑制肌肉肌酸激酶（Mck）的活性，從而對生肌過程進行調(diào)控；降低mstn的表達，則可提高這三者的表達及活性，另外這一操作中未發(fā)現(xiàn)Igf-1、myf5和Desmin存在顯著的改變，該結(jié)果可能與種屬特異性有關(guān)。在體外實驗中，mstn能控制myogenin和肌球蛋白重鏈（MHC）的表達，而這兩者是成肌細胞分化過程中起負向調(diào)節(jié)作用。

總體來說，在成肌細胞的增殖和分化過程中，MRFs家族成員先后表達，mstn可對myod等因子進行表達調(diào)控，具體情況如圖1 所示。Cdk 又稱細胞周期蛋白依賴性激酶，是能保證細胞周期過渡的一種限速酶，也是整個細胞周期調(diào)控機制的核心［29］。Cdk 的活性直接受周期蛋白依賴激酶抑制因子p21的影響，而mstn能特異性提高后者的表達，降低周期蛋白依賴性激酶2（Cdk2）的活性，使成肌細胞的生長停滯于G1 期，其增殖過程受到影響［30］。不過，當成肌細胞處于分化階段時，mstn會抑制p21的表達。另外，mstn通過smad3對myod與myogenin的表達活性進行調(diào)控，保證成肌細胞在正常狀態(tài)下分化成多核肌管［31］。而在抑制Mstn蛋白的活性后，動物體身上出現(xiàn)增生和肥大的現(xiàn)象可能是成肌細胞增殖和分化失調(diào)的結(jié)果。

圖1 mstn在成肌細胞增殖和分化過程中的表達調(diào)控Fig.1 Expression regulation of mstn in myoblast proliferation and differentiation

空間、溫度、食物等多種環(huán)境因素也會影響mstn的表達。已有研究表明，生存空間過度擁擠會使得斑馬魚mstnmRNA 的表達水平降低［32］。利用布氏鯧鲹（Trachinotus blochii）設置4 個溫度梯度（21、25、29 和33 ℃）進行實驗，發(fā)現(xiàn)魚體中腦和肌肉中的mstn-1在低溫時表達量較高，隨著溫度升高而降低，在29 ℃時表達量最低；中腦中的mstn-2在25 和29 ℃表達量較低，在21 和33 ℃表達量較高［33］。利用大黃魚（Larimichthys crocea）進行饑餓實驗，結(jié)果顯示在饑餓條件下，mstn-1在脾中表達量先下降后上升，mstn-2在肝中的表達量先上升后下降［34］。

此外，mstn的表達也受一些激素的影響。Rodgers 等［35］發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇會影響mstn在部分魚類中的表達，如尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）。環(huán)境壓力會導致皮質(zhì)醇升高，進而影響能量代謝［36］。Segev-Hadar 等［37］在尼羅羅非魚mstn的鑒定和表征實驗中分析了血漿中總蛋白和甘油三酯的水平。環(huán)境壓力會導致應激反應，但多個處理組與對照組的總蛋白和甘油三酯水平無明顯差異，而無飼料處理組血漿中的皮質(zhì)醇水平有升高的趨勢。皮質(zhì)醇對于mstn的影響，有待進一步研究。生長激素（GH）是脊椎動物生長的關(guān)鍵啟動子，對動物體肌肉組織的生長具有重大影響，所以GH 也能調(diào)節(jié)mstn的表達［38］。值得一提的是，虹鱒經(jīng)GH 處理后會導致其mstn前體的表達量增加；也有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)GH 基因大麻哈魚（Oncorhynchus keta）白肌組織中mstn前體得到高水平的表達［39-40］。這說明GH對mstn的作用可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯時期中。

3 Mstn的功能和作用機制

魚類Mstn 的時空表達特征較為獨特，但其基本功能仍然與兩棲類、鳥類和哺乳類的Mstn 類似［41］。Mstn 在肌肉組織分化過程中的作用模型如圖2所示，Mstn通過抑制成肌細胞增殖和多核肌管分化來調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量。

圖2 Mstn在肌肉發(fā)育中的作用模型Fig.2 The role model of Mstn in muscle development

McPherron 等［4］構(gòu)建了mstn突變純合體小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在出生前后其肌纖維數(shù)量和體積均得到提升，最終使得肌肉的體積增加。而在魚類的研究中也得出相似的結(jié)果，如利用RNA 干擾技術(shù)，注射mstnC 末端dsRNA 至斑馬魚的受精卵，可使早期胚胎增生或肥大［42］。利用基因組方法靶向誘導的局部病變制備mstn缺陷的青鳉（Oryzias latipes），發(fā)現(xiàn)青鳉Mstn 在孵化后對肌纖維的大小及數(shù)量具有暫時性的調(diào)控作用，在成魚階段的肌纖維數(shù)量比野生型增加了1.3倍，實驗組的肌纖維數(shù)量、每個標準長度在各個生命階段中均高于對照組［43］。

在肌肉生長發(fā)育的過程中，Mstn 與細胞周期密切聯(lián)系，通過作用于肌細胞控制后者在細胞周期G1 期至S 期中的轉(zhuǎn)變。另外，Mstn 在分泌后可作用于肌衛(wèi)星細胞，使其狀態(tài)保持靜止。Wang等［44］研究表明，抑制小鼠mstn的表達可激活肌衛(wèi)星細胞，但在mstn-/-小鼠中，成年小鼠的肌衛(wèi)星細胞數(shù)量保持不變。也有學者發(fā)現(xiàn)基于mstn被敲除的條件下，肌肉發(fā)生的肥大現(xiàn)象先于肌衛(wèi)星細胞的激活［45］。由此可見，肌衛(wèi)星細胞的活性受Mstn 的負向調(diào)控，但肥大現(xiàn)象和肌衛(wèi)星細胞的激活之間并無明顯關(guān)聯(lián)。不過，關(guān)于魚類肌衛(wèi)星細胞的研究較少，目前研究僅在斑馬魚、鯉等魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)肌衛(wèi)星細胞［46］。有學者利用肌肉注射法對鯉的肌衛(wèi)星細胞進行標記，為其進一步研究提供了幫助［47］。

Mstn的作用方式有自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌3種［48］。在哺乳動物中，激活素IIb型受體（Act RIIB）被認為是Mstn 和其他TGFb配體的受體。而在大西洋鮭（Salmo salar）［49］、斑馬魚［50］等魚類的許多組織中均發(fā)現(xiàn)該受體的表達，這表明魚類Mstn 可能以自分泌的方式在這些組織中發(fā)揮作用［51］。Mstn 前體蛋白經(jīng)過特異性結(jié)合后，通過蛋白和非Smad 蛋白兩種信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)其生物學功能［52］。

3.1 Smad蛋白信號通路

在Mstn 實現(xiàn)其生物學功能的兩種信號轉(zhuǎn)導途徑中，以Smad 蛋白介導的信號通路最為典型。如圖3 所示，Mstn 前肽可直接與成熟的Mstn 結(jié)合來阻止整個信號轉(zhuǎn)導過程的發(fā)生。激活的肌肉生長抑素二聚體（成熟的Mstn）與Act RIIB 結(jié)合，通過轉(zhuǎn)磷酸化募集并激活Act RIB/TβRI。Smad2/Smad3隨后被激活，與Smad4 形成一個復合體，該復合體會在細胞核激活靶基因的表達。靶基因被激活的同時，Smad7的表達水平也會相應地提高。在這一過程中，Smad7的高水平表達與其調(diào)控序列上的SBE有關(guān)，它能與Smad2/Smad3 和Smad4 組成的復合體結(jié)合。Smad7 對Smad2/3 的磷酸化存在抑制作用，復合體的形成由此會受到影響，使得mstn的轉(zhuǎn)錄水平降低，實現(xiàn)負反饋調(diào)節(jié)［53］。

近年來，不少學者對魚類Smad 蛋白信號通路也進行了研究。如在牙鲆（Paralichthys olhaceus）中 發(fā) 現(xiàn) 了4 種smad4s（PoSMAD4a、PoSMAD4b、PoSMAD4c、PoSMAD4d），它們在蛋白結(jié)構(gòu)、表達模式和亞細胞定位等方面的特性存在一定程度的差異［54］。在斑馬魚補償性生長實驗中，使用顯性陰性LAPD76A 重組蛋白滅活Mstn，導致Smad 蛋白信號通路失活。與對照組相比，經(jīng)過處理的斑馬魚肌肉肥大，其生長性能得到改善［55］。mstn表達量的降低對于肌肉補償性生長具有重要的調(diào)節(jié)作用，這一結(jié)果為制定提高魚類生長速度的策略提供了理論依據(jù)。另外，也有學者指出魚類肌肉中Smad 的磷酸化可能會隨著魚類的種類或發(fā)育階段的改變而改變，這個問題需要進一步研究［43］。

3.2 非Smad蛋白信號通路

除Smad 蛋白外，Mstn 還可以通過非Smad 蛋白途徑進行信號轉(zhuǎn)導，如MAPK 信號通路。Smad蛋白信號通路與MAPK 信號通路存在某種協(xié)同作用，不同的是，Mstn 可通過后者引起心肌細胞的定向表達，導致心肌細胞纖維化，損害老年小鼠的心臟功能，但這一結(jié)論缺乏直接證據(jù)［56］。此外，p38信號轉(zhuǎn)導的激活與Mstn促進骨骼肌纖維化的活性無顯著性關(guān)聯(lián)［57］。MAPK 信號通路的主要過程是激活TAK1 和MKK3/6，從而刺激p38，后者促進I 型膠原蛋白的表達，該表達受p38MAPK 激酶抑制劑影響。有學者研究發(fā)現(xiàn)，該抑制劑可在C2C12細胞中利用TAK1-MKK6信號通路激活，從而實現(xiàn)Mstn對成肌細胞的抑制作用［58］。至于Mstn對魚類心臟是否具有類似纖維化的影響，需要進一步討論。

另外，Mstn 也激活了由Ras 介導的ERK 通路。該通路誘導細胞周期阻滯、肌管的形成以及肌源蛋白和其他肌肉特異性蛋白的表達，阻止肌細胞的分化和再生［59］。圖3 中，DA-Raf 是ERK 通路的顯性負向拮抗劑，也是肌源性分化的正向調(diào)控因子。研究表明，在ERK 通路中，MEK 抑制劑U0126 和曲美替尼可以解除mstn誘導的抑制作用，這些藥物可能適用于治療肌少癥或肌肉萎縮［60］。

圖3 mstn信號通路Fig.3 The mstn signaling pathway

4 魚類Mstn的應用和研究前景

魚類Mstn 具有十分廣泛的應用和研究前景。以生長相關(guān)候選基因的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)性為基礎(chǔ)，篩選出與優(yōu)良經(jīng)濟性狀相關(guān)的位點，有利于在繁殖親本的早期培育過程中提高選育效率，達到縮短良種培育時間的目的［61-62］。近年許多研究中，mstn被視為魚類生長性狀遺傳改良的重要候選基因之一，與魚類的生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析。如張世勇等［63］在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中發(fā)現(xiàn)了其mstn第2 內(nèi)含子上存在1 個SNP 位點，該位點與魚體質(zhì)量和體長顯著性相關(guān)。目前的研究說明，魚類mstn上的SNP 位點與某些特定的生長性狀相互關(guān)聯(lián)，但種類、環(huán)境等因素導致SNP位點和相關(guān)特性存在差異。

由于部分魚類在時空表達特征上存在差異，在未來的研究中可利用基因敲除技術(shù)，探究Mstn在魚類其他組織中的生物學功能。如構(gòu)建泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）mstn敲除模型，發(fā)現(xiàn)該基因的缺失除了促進肌肉組織生長外，還會導致組織中的脂肪合成減少，從而降低脂肪的沉積，該結(jié)果通過影響能量代謝來實現(xiàn)［64］。不過，Mstn影響魚類脂肪代謝的機制還未知，且Mstn 對脂肪可能具有雙重調(diào)節(jié)作用，需要進一步的研究。斑馬魚mstn被敲除后發(fā)現(xiàn)其F2 代存活率降低，并對免疫系統(tǒng)造成損害［65］。構(gòu)建大口黑鱸（Micropterus salmoide）的mstn真核表達載體，研究其在肌肉中的表達，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)Mstn 前肽的表達水平與時間相關(guān)［66］。這一研究方向可能會遇到如敲除基因后出現(xiàn)肌纖維肥大，但不增生、體質(zhì)量或體長沒有明顯變化等現(xiàn)象，需要進一步探討。

5 小 結(jié)

與哺乳動物相比，魚類Mstn 存在不同的時空表達特征，具有調(diào)控其他組織生長發(fā)育的生物學功能，主要以Smad 蛋白等途徑負向調(diào)控肌肉組織的生長。此外，魚類Mstn 的研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)遺傳育種方面得到了一定程度的應用。但是除了肌肉組織外，Mstn 對魚類腦、性腺等組織的作用機制未知，需要進一步深入研究；Mstn 如何與皮質(zhì)醇等因子互作、如何調(diào)控魚類脂代謝等生理過程仍不清楚；Mstn 是否會通過MAPK 信號通路影響魚類心肌纖維化，mstn表達的信號轉(zhuǎn)導機制網(wǎng)絡需要進一步完善。只有闡明上述機制，才能更好地了解Mstn 參與魚類生長發(fā)育的過程，為Mstn的實際應用提供理論基礎(chǔ)。