鞍帶石斑魚Epinephelus lanceolatus卵子的短期保存*

魏千皓，葉智鋒，王崇偉，林浩然，李水生，張勇

有害生物控制與資源利用國家重點實驗室/廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室/中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275

鞍帶石斑魚Epinephelus lanceolatus隸屬鱸形目，鮨科，石斑魚屬，主要分布于印度-太平洋地區，是大型的珊瑚礁魚類。目前報道最大的鞍帶石斑魚個體長達2.7 m，體質量可達400 kg［1］。鞍帶石斑魚生長速度快，味道鮮美，是我國和東南亞國家重要的海水養殖魚類。然而，鞍帶石斑魚人工繁殖難度大，受精卵價格昂貴。近年來，每公斤受精卵的價格在3 萬～6 萬元之間，仍供不應求。鞍帶石斑魚的卵子主要通過激素催產獲得，其活力在接觸海水后迅速下降，從而導致受精失敗。配子保存是提高魚類人工繁育效率的有效策略。目前，鞍帶石斑魚精子的長期保存研究已經開展［2-3］。冷凍保存后的精子已應用于不同石斑魚的種間雜交［4-5］。但是，鞍帶石斑魚卵子保存的研究尚未見報道。

由于魚類卵子的結構復雜，很難像精子一樣進行長期保存，相較而言，短期的體外保存是可行的途徑。在金魚、鯉魚、虹鱒、小體鱘和梭鱸等魚類中，已經開展了卵子的短期保存研究［6-11］，發現體外保存的卵子在數小時至數天內仍能保持較高的活力。對于生產和科研工作來說，短期內保持卵子活力有助于人工授精和孵化管理，可提高人工繁育的效率。為了保持鞍帶石斑魚卵子的活力和延長體外保存的時間，本研究對卵子體外保存的條件進行研究，建立適用于鞍帶石斑魚卵子體外保存的方法。

1 材料和實驗

1.1 配子收集

鞍帶石斑魚的卵子采集于海南晨海水產有限公司感城養殖基地。于2020 年6～10 月，選擇處于生殖季節、腹部隆起、生殖孔紅腫凸起的鞍帶石斑魚親魚（10～12 齡，體質量60～70 kg），在人工催產后，通過擠壓腹部使精子或卵子流出。將精液收集于50 mL 離心管中，然后4 ℃儲存直至使用。將卵子收集于干燥潔凈的500 mL玻璃燒杯中，然后分別放置于塑料培養皿中進行實驗。

1.2 受精實驗

將精子和卵子置于燒杯中輕輕混合，然后加入過濾海水激活精子與卵子。3 min 后，用干凈的海水清洗受精卵兩次，然后轉移至裝有10 L 的海水塑料桶中。在培育的過程中，保持充氣。培育4 h 后，待受精卵發育至囊胚期，在解剖顯微鏡下觀察，計算受精率［（受精率=（受精卵總數/卵子總數）×100%，n=1 000顆］。培育20 h后，在解剖顯微鏡下觀察，計算孵化率［孵化率=（孵化幼魚總數/卵子總數）×100%，n=1 000顆）。

1.3 實驗設計

以逐步進行的方式設計了6個實驗。每個實驗設3個重復，每個重復卵子總數為n=1 000顆。

1.3.1 卵子保存培養基的確定 以無酚紅的Leibovitz's L-15（L-15）培養基、Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 （DMEM/F12）培養基、 Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI-1640）培養基、DMEM 培養基作為基礎保存液。以上培養基購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。卵子和培養基大約按1∶6 的比例混合，28 ℃放置2 h，然后檢測卵子的受精率與孵化率。

1.3.2 保存溫度的測定 根據實驗1 的結果，將卵子置于L-15 培養基中，在不同溫度（16、22、28和32 ℃）下保存2 h，然后檢測卵子的受精率與孵化率。

1.3.3 培養基pH 值的測定 為了確定卵子保存的最佳培養基pH 值，根據實驗1 和2 的結果，將卵子分別放置在pH 值為7.4、7.8、8.1、8.5的L-15 培養基中。2 h 后，檢測卵子的受精率與孵化率。

1.3.4 保存時間對卵子活力的影響 根據實驗1、2 和3 的結果，將卵子保存在22 ℃的L-15 培養基（pH=8.1）中，分別在不同的保存時間（0、1、2、4 和6 h）后檢測卵子的受精卵與孵化率。

1.3.5 不同血清對卵子活力的影響 為了延長卵子保存的時間，將不同劑量的胎牛血清（FBS，fetal bovine serum）和鞍帶石斑魚血清（GGS，giant grouper serum）分別添加進L-15 培養基（pH=8.1）中。然后，將卵子置于含有血清的L-15 培養基中，22 ℃保存4 h，檢測卵子的受精卵與孵化率。鞍帶石斑魚血液樣品采集于處在繁殖季節的親魚，4 ℃以8 000×g速度離心15 min，分離血清樣品，放置-80 ℃冰箱儲存。

1.3.6 維生素預混料對卵子活力的影響 基于上述的實驗結果，為了進一步延長卵子保存的時間，將20 mg/L 維生素預混料（廈門惠盈動物科技有限公司）添加入含有0.1 μL/mL鞍帶石斑魚血清的L-15 培養基（pH=8.1）中。然后，將卵子置于添加維生素的培養基中，22 ℃時分別在0、2 、4 、6和8 h后檢測卵子的受精率和孵化率。

1.4 統計分析

實驗結果采用SPSS 23.0（SPSS，Chicago，IL，USA）進行統計分析。所有數據均表示為平均值±S.E.M.。百分比數據在反正弦變換后進行單因素方差分析檢驗各組之間差異性，利用Fisher的最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較，取P<0.05為顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 卵子短期保存條件的優化

剛擠出來的卵子，不經過保存立即授精，其受精率和孵化率分別為（75.6±5.31）%和（59.7±6.92）%（表1）。而未受精的卵子在28 ℃下直接暴露于空氣中2 h，則完全失去活力。在28 ℃下，卵子在不同培養基中保存2 h 后，活力出現了顯著下降，受精率均低于50%（表1）。與在其他培養基中保存的卵子相比，在L-15 培養基中保存的卵子具有相對較高的受精率［（44.2±0.73）%］和較高的孵化率［（25.4±2.42）%］（表1）；表明L-15 培養基可能更適合作為卵子保存的培養液。在L-15 培養基中，保存溫度為16 ℃和22 ℃時，卵子的受精率和孵化率明顯高于28 ℃和32 ℃保存的卵子（表2）。由于卵子22 °C 保存后的受精率和孵化率高于16 ℃保存后的受精率和孵化率，因此選擇22.0 ℃作為后續實驗的保存溫度。隨著pH 從7.4 升高到8.1，受精率與孵化率有增加的趨勢，但是統計數值沒有顯著差異（表3）。然而，由表3 可知，在培養基pH=8.1 時，保存后卵子的受精率和孵化率明顯高于在pH=8.4 時的受精率和孵化率。基于上述結果，組合優化好的保存條件（22 ℃，pH=8.1 的L-15 培養基），對卵子體外保存的時間進行測試，結果見圖1。圖1顯示，卵子在保存液中2 h后，其受精率和孵化率分別為（66.4±2.70）%和（47.9±1.28）%；4 h 后，分 別 降 至（45.6±2.05）%和（25.8±1.67）%；6 h 后，分別降至（25.3±1.67）%和（11.6±1.06）%。

表1 鞍帶石斑魚卵子28 ℃時在不同培養基中保存2 h后的受精率和孵化率1）Table 1 Fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in different media at 28 ℃for 2 h

表2 溫度對鞍帶石斑魚卵子在L-15培養基中保存2 h后的受精率和孵化率的影響1）Table 2 Effects of temperatures on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium for 2 h

表3 鞍帶石斑魚卵子22 ℃時在不同pH值的L-15培養基中保存2 h后的受精率和孵化率1）Table 3 Effects of pH on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 2 h

2.2 添加劑對卵子短期保存的影響

為了延長卵子保存時間，在L-15 培養基中分別添加FBS 和GSS。如表4 所示，當添加FBS 時，幾乎所有卵子都在保存4 h 后失去活力。而添加GSS 可以顯著提高卵子的活力。在含有0.1 μL/mL GGS的L-15培養基中，保存4 h后的卵子的受精率與孵化率分別為（67.6±2.88）%和（46.3±0.68）%（表4）。將20 mg/L 的維生素預混物添加進含有0.1 μL/mL GGS 的L-15 培養基中，卵子保存的時間得到了明顯地提高。在保存8 h 后，卵子的受精率 和 孵 化 率 分 別 為（64.4±1.87）% 和（44.8±1.76）%，與4 h 和6 h 時的數值沒有顯著性差異，低于對照組（圖2）。

圖2 22 ℃L-15培養基（pH=8.1）添加鞍帶石斑魚血清和維生素預混料后，卵子不同保存時間后的受精率和孵化率Fig.2 The fertilization and hatching rates of giant grouper eggs at different storage time points in L-15 medium(pH=8.1)with supplementation GGS and vitamin premix at 22 ℃

表4 鞍帶石斑魚卵子22 ℃時在含不同血清的L-15培養基中保存4 h后的受精率和孵化率1）Table 4 Effects of sera supplementation on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 4 h

3 討 論

3.1 卵子保存的基礎培養基探討

本研究首先對鞍帶石斑魚卵子體外保存的培養液進行探討。L-15、DMEM/F12、RPMI-1640 和DMEM 培養基常用于動物細胞培養。我們對這4種培養基進行了測試，結果表明，卵子保存在L-15培養基中具有較高的受精率和孵化率（表1）。L-15是魚類卵母細胞培養常用的培養基，具有維持卵母細胞活力的功能［12-14］。我們先前的研究亦表明，在L-15 培養基中，斜帶石斑魚的卵泡經類固醇激素誘導后可以發生生發泡破裂；卵母細胞可以正常恢復第一次減數分裂［15-16］。這些研究表明，L-15可用為石斑魚卵子保存的基礎培養基。

3.2 溫度和pH對卵子保存的影響

溫度是影響卵子保存效率的關鍵因素。不同魚類的卵子對保存溫度的要求有很大的差別。有研究推測，保存溫度可能與魚類棲息地的溫度有關。冷水性魚類的卵子比暖水性魚類的卵子更能耐受較低的保存溫度［8，17-18］。鞍帶石斑魚是一種熱帶魚類。在海南省，其繁殖最適水溫為28～32 ℃。我們的結果表明，當保存溫度為16 ℃和22 ℃時，卵子擁有較高的受精率和孵化率。因此，鞍帶石斑魚卵子保存的適合溫度為16 ～22 ℃。卵子保存的最適溫度低于養殖的最適溫度的現象在其他魚類中也被觀察到。例如，小體鱘親魚在15 ℃下養殖，但卵子保存的適合溫度在7～11 ℃［8］。克林雷氏鯰的卵母細胞保存溫度為15 ℃，但親魚繁殖的水溫為25 ℃［19］。目前，關于卵子保存溫度低于親本養殖溫度的原因仍然未知。我們推測較低的溫度可能會降低卵細胞內的代謝活動，從而有助于維持卵子的活力。多項研究發現，pH 值的變化也會影響體外保存的卵子的活力［10，20-21］。虹鱒卵子在pH=8.2 的培養基中保存3 d 后的受精率高于在pH=9 和pH=10 的培養基中［10］。我們的研究發現，當卵子保存在pH=8.5 的L-15 培養基中，其活力顯著降低，但在pH 為7.4、7.8 和8.1 的培養基中，卵子的受精率和孵化率差異不顯著（表3）。由于pH 為8.1 時，保存后卵子的受精率和孵化率最高，因此建議鞍帶石斑魚卵子保存在pH=8.1 的培養基中。根據優化的保存條件，在22 ℃下，卵子在L-15培養基（pH=8.1）中保存2 h后的受精率和孵化率分別為66.4%和47.9%（圖1），相比在未優化條件下，分別提高了22.2%和22.5%（見表1）。盡管如此，隨著保存時間的延長，卵子的活力仍急劇下降。在體外保存超過4 h 后，卵子的受精率和孵化率均顯著降低。

3.3 血清在卵子保存中的作用

因血清含有許多細胞生長必需的營養物質，被廣泛用于細胞培養。為了延長鞍帶石斑魚卵子保存的時間，我們嘗試在L-15 培養基中分別添加FBS 和GGS。結果表明，添加FBS 對鞍帶石斑魚卵子保存不利。在添加FBS 培養基中，我們觀察到卵子內部含有分散的油球。油球被認為是海洋魚類漂浮性卵子質量的重要指標［22-23］。在石斑魚卵母細胞成熟過程中，眾多小油球逐漸融合成一個較大的油球［15-16，24］。含有多油球的卵子其受精率顯著下降和孵化率低下［25］。在此，因FBS 添加而引起卵子內形成多油球現象的原因尚不清楚。卵子在添加GGS的L-15培養基中保存4 h后，受精率和孵化率都有了顯著的提高。在梭鱸、露斯塔野鯪和小體鱘中，利用卵巢液成功地建立了卵子短期保存系統［8，11，26］。這些研究表明，魚類體液適合維持卵子的活力，有助于延長保存的時間。此外，本研究還發現補充維生素預混料可有效地延長卵子的保存時間。在保存8 h 后，卵子的受精率仍保持在60%以上。研究表明，維生素對親魚的繁殖性能和卵子質量起著關鍵作用［27］。在親魚培育中，通常在飼料中補充維生素以促進卵子發育。然而，維生素對體外卵子保存的作用尚不清楚。一些維生素具有抗氧化的功能，在卵子保存過程中可能起到減少氧化反應的作用。

綜上所述，我們成功地建立了鞍帶石斑魚卵子體外短期保存的方法。保存溫度為22 ℃時，在添加鞍帶石斑魚血清和維生素的L-15 培養基（pH=8.1）中，卵子可以在體外進行短期的保存（約8 h）。該保存系統有助于提升鞍帶石斑魚的人工繁育、孵化管理和雜交試驗等生產實踐的效率。