知母內(nèi)生真菌多樣性及其對淺表感染真菌的體外拮抗活性*

李佳琪，胡海艷，姚華雄，李鑒濱，陳美琪，王俊彥，周曉鈴，鄧祖軍

1. 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006

2. 廣州市微生物研究所，廣東 廣州 510663

淺表感染真菌感染（SFIs，superficial fungal infections）常由皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌這3類親人性病原真菌引起。皮膚癬菌侵犯人的皮膚、指甲和毛發(fā)引起手足癬、甲癬、頭癬等皮膚癬菌病［1］。白色念珠菌Candida albicans主要引起陰道、胃腸道和口腔的淺表感染，馬拉色菌則與花斑癬、毛囊炎以及脂溢性皮炎有關(guān)［2］。現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，全球SFIs 的發(fā)生率高達20%～25%，已成為影響人類健康的重要疾病之一［3］。目前淺表感染真菌的耐藥率越來越高［4-5］，而且針對SFIs的治療藥物抑菌活性較差、起效時間較慢，治療過程中也存在易復(fù)發(fā)、穩(wěn)定性較差等問題，從而導(dǎo)致現(xiàn)有藥物治療的臨床效果不佳［6］，因此尋找和開發(fā)新的抗SFIs藥物顯得十分必要［7］。

知母Anemarrhena asphodeloides屬于百合科Liliaceae 知母屬Anemarrhena，是1 種多年生草本藥用植物，其干燥根狀莖是我國的傳統(tǒng)中藥，味苦、性寒，具有清熱瀉火、滋陰退蒸、生津止渴的功效，在外感風(fēng)熱、肺熱燥咳、腸燥便秘等癥的治療中有著廣泛的使用［8-9］。現(xiàn)有研究證明知母提取物對淺表感染真菌具有較好的抑制活性。例如，吳潤標(biāo)等［10］發(fā)現(xiàn)知母提取物在體外對疣狀毛癬菌Trichophyton verrucosum具有較強抑制作用。Lida 等［11］采用生物細(xì)胞示蹤法分離出知母中的Nyasol 對毛癬菌屬、念珠菌屬等多株供試皮膚真菌有抗菌活性。巨艷紅等［12］發(fā)現(xiàn)知母提取物乳膏對豚鼠的須癬毛癬菌Trichophyton mentagrophytes感染具有良好的治療作用，且對皮膚無明顯致敏作用及毒性。知母的β-葡萄糖苷酶水解物對4種皮膚真菌：白色念珠菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌Microsporum gypseum、紅色毛癬菌Trichophyton rubrum均有顯著的抑制活性，對石膏樣小孢子菌的抑制活性甚至優(yōu)于氟康唑［13］。隨著知母藥材出口量和國內(nèi)市場需求量的不斷增加以及隨之而來的過度采挖，致使野生知母資源已近枯竭［9］，因此尋找知母藥用資源的替代利用方式顯得非常必要。藥用植物內(nèi)生真菌由于長期與宿主的協(xié)同進化，可能會產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性成分［14-16］，而且其所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，具有抑菌、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗炎癥和免疫抑制等多種生物活性，代謝產(chǎn)物的類型超過了其植物代謝產(chǎn)物的范圍［17］，因而藥用植物內(nèi)生真菌已成為尋找新型活性物質(zhì)的重要新資源［18］，同時也為藥用植物資源的保護與替代利用提供了新途徑。但目前未見關(guān)于知母內(nèi)生真菌類群及其抗真菌活性的研究報道。本研究擬系統(tǒng)分析知母內(nèi)生真菌的多樣性，并對其發(fā)酵液對紅色毛癬菌、犬小孢子菌Microsporum canis、黏膜毛孢子菌Trichosporon mucoides、糠秕馬拉色菌Malassezia furfur和白色念珠菌等5 種淺表感染真菌的體外抗菌活性進行分析，以期篩選出具良好抗性的內(nèi)生真菌菌株，為知母藥用資源的挖掘與利用提供新途徑，同時也為抗SFIs 新藥開發(fā)提供新的菌種資源庫。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥用植物 供試植株為河北保定太行山北部東麓采集的3年生以上的健康野生知母。采樣地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫13.0 ℃，年平均降雨量532 mm。采樣時，將知母整株拔出（根帶土）置于4 ℃冰箱保存，48 h 內(nèi)進行內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 供試病原真菌 犬小孢子菌Microsporum canis、紅色毛癬菌Trichophyton rubrum、黏膜毛孢子菌Trichosporon mucoides、糠秕馬拉色菌Malassezia furfur、白色念珠菌Candida albicans，菌株來自廣東藥科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室。

1.1.3 主要試劑 引物（ITS1 和ITS4）、DNAMarker，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR預(yù)混液2×ProTaq Master Mix（dye plus），湖南艾科瑞生物工程有限公司；真菌DNA 小量提取試劑盒HiPure Fungal DNA Mini Kit，Magen公司；馬鈴薯葡萄糖固體（PDA）和液體（PDB）培養(yǎng)基、糠秕馬拉色菌培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 采用Deng 等［19］的方法從知母中分離內(nèi)生真菌：將知母植株在流水下進行充分清洗，去除表面塵土后用消毒剪刀將根、莖、葉其剪成適當(dāng)長度，放至載有無菌濾紙的無菌玻璃皿中將表面水分吸干。樣品經(jīng)過表面消毒（φ=75%酒精2 min，w=5%有效氯的次氯酸鈉溶液1 min）后， 用無菌水沖洗3 遍，取最后1次清洗的無菌水涂布PDA平板，對表面消毒效果進行檢測。晾干后的樣品用無菌剪刀將組織剪成小片，接種至PDA 平板，每個平板上5 個組織塊，28 ℃暗培養(yǎng)，每日觀察。觀察到菌絲從組織切口處長出，及時用接種針挑取轉(zhuǎn)至另一新的PDA 平板上，如此數(shù)次直至菌落形態(tài)典型無雜菌時即可轉(zhuǎn)入斜面試管中培養(yǎng)保存。

1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定 根據(jù)Yu 等［20］的方案使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)的方法來鑒定內(nèi)生真菌。從純化的菌落中挑取菌絲和分生孢子，置于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)菌絲和分生孢子的形態(tài)特征，對其進行初步的鑒定［21］。使用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA（gDNA），經(jīng)電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物送去生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用BLAST（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi） 在GenBank中獲取該序列的相似序列信息，然后使用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［22］。

1.2.3 知母內(nèi)生真菌的液體發(fā)酵 加入1 個內(nèi)生真菌的菌餅（直徑0.5 cm）于100 mL PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1孵育7～10 d，將發(fā)酵液依次用滅菌紗布和無菌濾紙進行粗濾，最后用0.22 μm的一次性膜過濾器對粗濾液過濾除菌，待用［23］。

1.2.4 抗淺表感染真菌活性菌株的篩選 采用菌絲生長抑制法分析內(nèi)生真菌對犬小孢子菌、黏膜毛孢子菌、紅色毛癬菌體外抗菌活性［24］：制備PDA 培養(yǎng)基，稱量、溶解、分裝至大試管，每管分裝9 mL 滅菌備用。將除菌過濾后的內(nèi)生真菌發(fā)酵液分別取1 mL 至培養(yǎng)皿中，再將滅菌分裝好的PDA 迅速倒入加好發(fā)酵液的培養(yǎng)皿中充分混勻后靜置凝固。平板靜置過夜無菌生長后即可將3種皮膚癬菌的菌餅接種至平板中央，以未加發(fā)酵液的PDA 平板接種同樣大小的皮膚真菌菌餅作為對照，一同放入28 ℃培養(yǎng)7 d，處理組與對照組的菌落直徑（d）均采用十字交叉法測量。

菌絲生長抑制率計算公式為

菌株發(fā)酵液對糠秕馬拉色菌和白色念珠菌的活性測定采用瓊脂擴散法［25］：將糠秕馬拉色菌和白色念珠菌分別接種于馬拉平板和PDA 上30 ℃活化48 h，接種環(huán)挑取平板上的純培養(yǎng)菌落，置于5 mL 滅菌生理鹽水中研磨混勻，用1.0 號麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管將菌懸液濃度調(diào)整為1.0×107CFU/mL。移液槍吸取菌懸液100 μL 至已倒好的平板上，涂布棒涂布均勻，待菌液稍干后用孔徑6 mm 的打孔器分別在每個培養(yǎng)基上打4 個孔，每孔加20 μL 融化的培養(yǎng)基封底，3個孔各加入50 μL發(fā)酵液，1個孔加生理鹽水作陰性對照，4 ℃低溫擴散2 h，30 ℃培養(yǎng)36～48 h后觀察并記錄孔洞周圍的抑菌圈大小，每個菌株平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

知母內(nèi)生真菌的定殖率（CR）、分離率（IF）、相對分離頻率（RF）、多樣性指數(shù)（H'）、均勻度指數(shù)（E）以及相似性指數(shù)（Cs）參考文獻［26］進行計算，不同部位的比較采用Duncan 多重比較法，統(tǒng)計顯著水平值設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 知母內(nèi)生真菌的分離率與定殖率

表面消毒后的沖洗水樣未見菌生長，這表明分離到的菌株來源于知母植株內(nèi)部，屬于內(nèi)生真菌。共有438 株（隸屬于23 個屬）內(nèi)生真菌從知母根、莖、葉分離到，其根209 株、莖153 株、葉76株（表1）。根部內(nèi)生真菌的分離率與定殖率最高（分別為139.33% 和99.33%）， 其次為莖部（102.00%、74.00%），葉部最低（50.67%、47.33%）。

表1 內(nèi)生真菌在知母中的分離率和定殖率1）Table 1 The isolation rate and colonization rate of fungal endophytes of A. asphodeloides

2.2 知母內(nèi)生真菌的類群結(jié)構(gòu)

對438株知母內(nèi)生真菌經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察和分子鑒定后歸為23 個屬，其中鐮刀菌屬Fusarium和棘殼孢屬Setophoma為主要類群，分別占總數(shù)的66.89%和16.21%（表2）。知母不同部位內(nèi)生真菌的類群結(jié)構(gòu)存在差異：根部真菌有9個屬，其中鐮刀菌屬（60.29%）和棘殼孢屬（33.97%）為優(yōu)勢類群，帚枝霉屬Sarocladium、棘殼孢屬、小球腔霉屬Leptosphaeria、黑團孢屬Periconia和Dictyocheirospora僅分布在根部；莖部以鐮刀菌屬（91.50%）和粘帚霉屬Clonostachys（7.19%）為優(yōu)勢類群，粘帚霉屬只分布在莖部；葉部共有16 個屬，以鐮刀菌屬（35.53%）和鏈格孢屬Alternaria（14.47%）為主要類群，鏈格孢屬、炭疽菌屬Colletotrichum、尾孢菌屬Cercospora、枝孢菌屬Cladosporium和擬星衣屬Arthopyrenia等只在葉中分離到。

表2 知母內(nèi)生真菌的種類組成Table 2 The taxa of endophytic fungi in A. asphodeloides %

2.3 知母不同部位內(nèi)生真菌的多樣性和相似性分析

由表3可以看出，知母總的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)（H′）為1.33，不同部位的多樣性指數(shù)由高到低分別為葉（2.14）、根（0.96）、莖（0.33）；葉的均勻度指數(shù)（E）最高（0.77），其次為根（0.44）和葉（0.30）。分析不同部位之間的相似性系數(shù)可以看出：根和莖（Csroot-stem＝0.50）之間的群落組成為中等相似，莖和葉（Csstem-leaf＝0.12）、根和葉（Csroot-leaf＝0.32）之間的群落組成分別為極不相似和中等不相似（表3）。

2.4 知母內(nèi)生真菌的抗真菌活性

本研究從分離到的內(nèi)生真菌挑選出30 株代表菌株（表4）用于抗淺表感染真菌活性的篩選。從表5 可以看出，對犬小孢子菌、紅色毛癬菌、黏膜毛孢子菌、糠秕馬拉色菌和白色念珠菌具有抑制活性的菌株分別占總數(shù)的96.67%、 100.00%、100.00%、3.33%和3.33%；檢測的所有內(nèi)生真菌都至少對1種淺表感染真菌具有抑制作用；同時對這3種皮膚真菌（犬小孢子菌、紅色毛癬菌和黏膜毛孢子菌）具活性的菌株占96.67%。其中菌株ZML33和ZMR35的抑制效果最明顯，菌株ZML33的發(fā)酵液對犬小孢子菌、紅色毛癬菌、黏膜毛孢子菌3 種皮膚真菌的抑制率都高于70%，其中對犬小孢子菌的抑制活性高達89.65%。菌株ZMR35的發(fā)酵液則除了對犬小孢子菌（55.12%）、紅色毛癬菌（57.49%）、黏膜毛孢子菌（49.52%）這3種皮膚真菌有較強的活性外，還能抑制糠秕馬拉色菌的生長，瓊脂擴散實驗顯示其抑菌圈直徑大于18 mm（表5）。在GenBank中BLAST比對發(fā)現(xiàn)菌株ZML33 的 ITS 序 列 與Aspergillus niger（KF496078.1）的一致性高達99.65%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中可與2個Aspergillus niger參考序列形成一個支持度為100%的支（圖1），因而將其鑒定為Aspergillus niger；菌株ZMR35 的ITS 序列與黑團孢 屬 中 的Periconia macrospinosa（MT446142.1）的一致性高達99.81%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與2 個Periconia macrospinosa參考序列聚類成一個支持度為91%的分支（圖2），因而將其鑒定為Periconia macrospinosa。

圖1 基于ITS rDNA 序列構(gòu)建的內(nèi)生真菌菌株ZML33系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA gene sequence of endophytic fungus strain ZML33

圖2 基于ITS rDNA 序列構(gòu)建的內(nèi)生真菌菌株ZMR35系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA gene sequence of endophytic fungus strain ZMR35

表4 知母內(nèi)生真菌的分子鑒定Table 4 The molecular identification of endophytic fungi from A. asphodeloides

表5 知母內(nèi)生真菌發(fā)酵液對5種淺表感染真菌的抑制活性（±s，n=3）1）Table 5 Inhibitory activity of endophytic fungi fermentation broth from A. asphodeloides against five superficial pathogenic fungi（±s，n=3）

表5 知母內(nèi)生真菌發(fā)酵液對5種淺表感染真菌的抑制活性（±s，n=3）1）Table 5 Inhibitory activity of endophytic fungi fermentation broth from A. asphodeloides against five superficial pathogenic fungi（±s，n=3）

1）“－”：無抑菌活性；“＋＋＋”：抑菌圈直徑d ≥1.5 cm。

菌株抑制率/%紅色毛癬菌7.19±0.03 38.06±0.03 11.49±0.02 9.70±0.07 10.97±0. 01 15.23±0.04 57.49±0.01 39.96±0.02 19.61±0.03 20.56±0.03 1.34±0.04 9.67±0.10 5.44±0.05 3.94±0.06 23.01±0.03 18.70±0.01 6.06±0.44 3.83±0.44 5.09±0.02 17.36±0.02 1.17±0.04 21.73±0.07 12.85±0.04 8.05±0.03 9.57±0.05 72.32±0.03 6.71±0.03 28.08±0.05 3.86±0.03 5.51±0.03犬小孢子菌8.88±0.04 14.53±0.04 23.40±0.01-1.69±0.03 7.17±0.03 11.16±0.02 55.12±0.05 15.49±0.03 15.49±0.03 7.17±0.01 2.30±0.06 5.31±0.02 5.24±0.05 1.73±0.02 39.79±0.14 28.37±0.07 7.23±0.03 4.48±0.02 5.03±0.03 6.45±0.01 1.41±0.02 12.31±0.03 3.14±0.02 12.44±0.03 9.19±0.02 89.65±0.00 11.20±0.03 4.73±0.03 7.08±0.03 1.73±0.02黏膜毛孢子菌10.14±0.03 11.21±0.03 29.10±0.03 5.14±0.01 12.54±0.04 17.08±0.04 49.52±0.02 9.30±0.01 60.29±0.04 6.61±0.06 11.46±0.02 12.07±0.02 7.69±0.00 15.01±0.01 62.32±0.03 60.58±0.04 11.44±0.03 8.36±0.02 2.84±0.04 9.93±0.04 1.00±0.05 36.58±0.04 8.09±0.03 25.70±0.04 17.66±0.03 74.61±0.02 11.71±0.03 1.09±0.03 7.12±0.02 15.19±0.02抑菌活性白色念珠菌糠秕馬拉色菌Leptosphaeria sp. ZMR8 Setophoma sp. ZMR9 Setophoma sp. ZMR10 Setophoma sp. ZMR12 Dictyocheirospora sp. ZMR13 Myrothecium sp. ZMR25 Periconia sp. ZMR35 Fusarium sp. ZMR36 Trichoderma sp. ZMR40 Periconia sp. ZMR48 Fusarium sp. ZMS4 Clonostachys sp. ZMS16 Fusarium sp. ZMS17 Fusarium sp. ZMS26 Clonostachys sp. ZMS36 Trichoderma sp. ZMS37 Colletotrichum sp. ZML2 Cercospora sp. ZML8 Collariella sp. ZML12 Latorua sp. ZML16 Mucor sp. ZML17 Cladosporium sp. ZML28 Arthopyrenia sp. ZML29 Alternaria sp. ZML30 Albifimbria sp. ZML31 Aspergillus sp. ZML33 Curvularia sp. ZML36 Setophoma sp. ZML41 Stemphylium sp. ZML42 Phoma sp. ZML44－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

3 討 論

本研究從河北保定太行山野生知母的根、莖和葉子中分離出了23 屬438 株內(nèi)生真菌，表明藥用植物知母中的內(nèi)生真菌資源豐富。知母內(nèi)生真菌總的定殖率和分離率分別為73.56%和97.33%，總的多樣性指數(shù)為1.33，與孫劍秋［27］報道的我國北方地區(qū)15 科18 種常見藥用植物內(nèi)生真菌的多樣性結(jié)果相似。與Park 等［28］的研究結(jié)果類似的是，知母根部內(nèi)生真菌的分離率和定殖率最高。植物根部長期與土壤接觸，土壤中的微生物非常豐富且容易通過根部開口侵染植物，這可能是根部內(nèi)生真菌定植率和分離率高的原因，而葉子的生命期較短可能是其定植率和分離率低的原因［29］。內(nèi)生真菌在知母不同部位的類群結(jié)構(gòu)與分布也具有一定的專一性和差異性：知母根部、莖部和葉部的優(yōu)勢類群均是鐮刀菌屬，這與同為百合科藥用植物的貝母Fritillaria thnbergi、黃精Polygonatum sibiricum、劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis的研究結(jié)果一致［30-32］。有19 個屬的內(nèi)生真菌只定殖于根、莖、葉的其中一個部位，帚枝霉屬Sarocladium、棘殼孢屬、小球腔霉屬Leptosphaeria、黑團孢屬Periconia和Dictyocheirospora僅分布在根部，粘帚霉屬只分布在莖部，鏈格孢屬、炭疽菌屬Colletotrichum、尾孢菌屬Cercospora、枝孢菌屬Cladosporium和擬星衣屬Arthopyrenia等則只在葉中分離到。這一結(jié)果可能是由于知母不同部位的組織結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)條件不同所導(dǎo)致［33］。

SFIs 在全球的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，而現(xiàn)有的藥物存在抑菌能力較差、起效慢、容易耐藥、治療效果不穩(wěn)定、易復(fù)發(fā)等問題，總體治療效果不理想［6］，因此尋找新的活性物質(zhì)和藥物顯得十分必要［7］。藥用植物內(nèi)生真菌由于長期生活在植物內(nèi)部，與宿主植物存在“協(xié)同進化”的過程，它們可能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)［14-16］，另外也可能合成植物本身沒有的新型次生代謝產(chǎn)物［17］，因而藥用植物內(nèi)生真菌已成為新藥開發(fā)的一個重要資源庫［18］。有研究表明知母對毛癬菌屬、念珠菌屬等皮膚真菌有較強的抑制作用，但關(guān)于知母內(nèi)生真菌抗淺表感染真菌的活性研究未見報道。本研究對30 株代表性知母內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌實驗結(jié)果表明：對犬小孢子菌、紅色毛癬菌、黏膜毛孢子菌、糠秕馬拉色菌和白色念珠菌具有抑制活性的菌株分別占總數(shù)的96.67%、100.00%、100.00%、3.33%和3.33%，其中菌株P(guān). macrospinosaZMR35 對除白色念珠菌外的4 種皮膚真菌均有較強的抑制作用，菌株A. nigerZML33 則對犬小孢子菌、紅色毛癬菌、黏膜毛孢子菌這3 種皮膚真菌的抑制率高于70%。Bajpai等［34］和Shin等［35］的研究也證明了Aspergillus和Periconia對白色念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌等人類病原真菌具有強效活性。知母內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對毛癬菌屬、小孢子菌屬、念珠菌屬具有抑制活性，這與知母植物提取物的研究結(jié)果相似［10-13］。內(nèi)生真菌P. macrospinosaZMR35 對糠秕馬拉色菌具有良好的抑菌活性，而在知母提取物中卻未見相關(guān)報道。以上研究表明，知母內(nèi)生真菌為開發(fā)新的抗SFIs 治療藥物提供了重要的資源庫。