提取方法對漢麻葉大麻素成分及體外降糖降脂功能的影響*

李德海，馬可，張道明，尹靜

1. 東北林業大學林學院，黑龍 江哈爾濱 150040

2. 黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍 江哈爾濱 150040

漢麻Cannabis sativaL.是一種一年生雌雄異株的草本植物，早期漢麻因其莖稈、葉子中含有豐富的纖維被廣泛用于紡織工業中。近年來漢麻種子、葉子和其副產物中含有豐富的蛋白質、油脂、大麻素和非大麻素等成分而在化妝品、藥品和食品工業中得到廣泛研究與應用。雖然漢麻因含有致幻成癮的四氫大麻酚（THC）導致在許多地區被禁止使用，但THC 在醫藥治療疾病時可以用作麻醉劑［1］。為避免非法使用大麻作為毒品來娛樂吸食等，僅允許培養wTHC< 0.2%的工業大麻［2］。研究表明漢麻中含有豐富的大麻二酚（CBD）、大麻色烯、大麻環萜酚等大麻素類化合物，具有防治慢性疾病、增強記憶力、改善睡眠、降血糖血脂與抗氧化等作用。其中CBD 在高血糖狀態下對人體視網膜微血管內皮細胞（HRCECs）的增長具有一定的抑制作用，進而影響核轉錄因子（FOXO3a）的活性，最終抑制血管內皮生長因子（VEGF）的表達［3］。內源性大麻素系統可以降低肥胖小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平，通過拮抗劑抑制大麻素受體2（CB2 受體）起到控制肥胖和調節血糖水平的作用［4］。另外大麻籽油中含有大麻二酚、大麻酚、大麻萜酚等主要成分，可以顯著降低血清和肝臟的Lee′s 指數、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平、丙二醛含量、腎臟和附睪周圍脂肪組織的含量，提高血清和肝臟的高密度脂蛋白水平，增強超氧化物歧化酶活性，具有顯著的降血脂功效［5］。可見大麻酚類化合物具有調節血糖血脂的功能，對高血脂高血糖患者有輔助調節作用。

大麻素是大麻植株特有的活性成分，其中wCBD僅有1%～3%，這部分物質的提取、分離純化是該研究領域的難題，選擇適用于大麻素的提取方法對其純度的提高與產品開發利用具有深遠影響。目前關于火麻仁油中提取大麻素類化合物的報道指出，利用超聲波輔助提取法確定最佳提取工藝，使火麻仁油中大麻素類化合物提取得較完全，為其中大麻酚類化合物的含量測定奠定基礎［6］。以火麻葉為原料采用熱回流法提取大麻素中的大麻二酚，此法對浸膏得率與wCBD有顯著影響，但因需要加熱，故有消耗能量且費時費力的缺點［7］。為了進一步提高大麻素的提取效率，通過對超臨界二氧化碳萃取溫度、萃取時間、夾帶劑用量、萃取次數進行篩選，提高了3 種大麻酚的提取率，并且具有優良的抑菌性能［8］。但是超臨界二氧化碳設備投資大、能耗高，顯著提高了制備成本。近年來，生物酶法、超聲波［9］與高剪切輔助［10］等提取方式在成分提取方面越來越受到大家的關注，通過細胞壁分解酶對工業大麻葉進行酶解，經過溶劑萃取、脫色等過程，能夠大大提高大麻二酚的提取率［11］。采用超聲波技術從漢麻花中提取生物活性化合物多酚、黃酮與大麻素，使抗氧化活性有明顯的增強［12］。高剪切輔助提取法［13］至今并未有研究用于漢麻提取，因易操作且設備簡單、提取效率高、節約能源等優點，越來越受到重視。

因此本試驗為建立一種高效且保持大麻素活性的制備方法，以小葉漢麻為原料，探究了溶劑提取法、酶輔助提取法、超聲波輔助提取法、高剪切輔助提取法4 種提取方式對大麻素浸膏得率、wCBD以及體外降血脂血糖的影響，旨在為推動漢麻資源的利用及開發具有調節血糖血脂作用的健康產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小葉漢麻：產自黑龍江青岡縣，取葉子進行60 ℃烘干，粉碎，過60目篩備用。

試劑：對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（PNPG），上海麥克林生化科技有限公司；牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉，上海金穗生物科技有限公司；α-淀粉酶（76 000 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（70 萬U/mL）、纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（75 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；大麻二酚標準品，云南漢素生物科技有限公司；四氫大麻酚標準品，美國Sigma公司；甲醇為色譜級；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Thermo Fisher Q Exactive Focus 型超高效液相質譜聯用儀，美國Thermo公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；TGL-16G 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；AL-1041C 分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限責任公司；RE-52旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器公司；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FLUKO 高剪切乳化機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；EPOCH12 型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同提取方法制備漢麻葉大麻素浸膏 取一定量漢麻葉粉，分別采用以下4 種方法進行處理。

溶劑提取法［14］按照料（m，g）∶液（V，mL）=1∶4分別加入提取劑（φ=70%乙醇、φ=80%乙醇、φ=90%乙醇、φ=95%乙醇、無水乙醇、石油醚、正己烷，以及V乙醇∶V二氯甲烷=4∶6），在25 ℃下轉速為500 r/min的攪拌器中攪拌2.0 h。

酶輔助提取法根據參考文獻［15］稍做修改，預實驗基礎上，使用pH 5.0 的磷酸鹽緩沖溶液配制酶液。按料（m，g）∶液（V，mL）=1∶10 加入酶液，酶的添加量分別為：纖維素酶250 U/g（漢麻葉粉）、果膠酶2 500 U/g、纖維素果膠復合酶2∶1（500 U/g∶2 500 U/g）。在溫度50 ℃搖床內分別酶解時間（0.25、0.5、0.75、1.0 h），酶解后放入100 ℃中滅活5 min。取出冷卻至室溫，4 000 r/min 離心15 min 取沉淀，再加入料（m，g）∶液（V，mL）=1∶4的最佳提取溶劑（由溶劑提取法確定），然后將其置于轉速為500 r/min的攪拌器中快速攪拌3 h。

超聲波輔助提取法［16］以料（m，g）∶液（V，mL）=1∶4 加入最佳提取溶劑（由溶劑提取法確定），超聲溫度30 ℃，考察超聲時間（20、25、30、35、40 min）、超聲功率（180、240、300 W），超聲處理后溶劑提取30 min。

高剪切輔助提取法［17］以料（m，g）∶液（V，mL）=1∶4 加入最佳提取溶劑（由溶劑提取法確定），高剪切速率分別為（12 000、14 000、16 000、18 000 r/min），剪切時間（30、60、90、120、130 s）啟動高剪切10 s，暫停20 s為1個周期，溶劑再提取30 min。

以上所有樣品處理后，全部過濾取濾液。平行試驗3 次，得提取液，在60 ℃、0.05 MPa 條件下進行旋蒸除掉溶劑，得到膏狀物，該物質即為含有漢麻素的浸膏。分別以大麻素浸膏得率、wCBD、wTHC為指標來評價提取效果。

1.3.2 漢麻葉中大麻素浸膏得率測定 分別稱取漢麻葉粉，按1.3.1方法，在設定的溫度、時間等條件下提取，冷卻抽濾，將濾液在60 ℃下旋蒸濃縮制得浸膏。浸膏得率為

式中Y為浸膏得率（%）；G1為浸膏的質量（g）；G2為漢麻葉粉的質量（g）。

1.3.3 漢麻浸膏中CBD 與THC 含量測定 采用高效液相色譜法檢測，取漢麻葉的大麻素浸膏用甲醇配制成質量濃度1 mg/mL，微孔濾膜濾過，取濾液作為供試品溶液。參考孫孔春等［18］的方法，稍做修改。標準曲線的繪制：稱取10.000 1 mg 大麻二酚標準品，以甲醇定容制成母液（ρ=1 mg/mL），分別取20、40、80、120、160、200 μL，均放置于2 mL 容量瓶中，配制成ρ為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的標準品溶液。按條件進行檢測，以大麻二酚質量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線。Y=11.87X-40.126，R2=0.990 6，同以上方法配置四氫大麻酚標準品，繪制標準曲線Y=22.172X-1.536，R2=0.999 9。適用范圍：0.01～0.1 mg/mL。色譜條件：色譜柱，Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速，1.0 mL/min；檢測波長，230 nm；進樣量，10 μL；柱溫，30 ℃；以V甲醇∶V水=85∶15 為流動相進行等度洗脫。在此色譜條件下，取大麻素樣品進樣分析。

1.3.4 超高效液相質譜聯用技術對浸膏中大麻素類成分分析 取4 種提取方法制備的漢麻葉浸膏0.001 0 g 用甲醇定容至10 mL，8 000 r/min 離心20 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取濾液作為樣品溶液備用。UPLC-Q Exactive Focus MS/MS 分析條件：使用GOLD VANQUISH 色譜柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm；流動相A 為甲酸水溶液，φ=0.1%，B 為甲醇溶液；梯度洗脫的設置如下：從φ=2% 到φ=98%B 的線性梯度為0.0～9.0 min；9.1～12.0 minφ=98%B；12.1～15.0 min 回到φ=2%B，平衡柱5 min，總運行時間為15 min。柱溫40 ℃；流速設定為0.350 mL/min；樣品進樣量為5μL。

質譜同時在正、負離子模式下檢測：電噴霧離子化電離源（HESI）；毛細管溫度320 ℃；汽化器溫度350 ℃；電噴霧電壓3 kV；鞘氣體積流量40 個單位；輔助氣體積流量10 個單位；質譜分辨率17 500 FWHM；掃描范圍為m/z80～1 200；AGC設置為1e5；NCE值分別為20、40和60 eV。

采用Compound Discoverer 3.2軟件和compounds化學成分數據庫信息進行匹配，初步進行分析，與ChemSpider、mzCloud、mzVault 等數據庫對比。通過質譜圖、相對分子質量、一級、二級碎片離子和化學結構與參考文獻信息分析后確定物質名稱與分類［19］。

1.3.5 大麻素類體外降血糖功能的研究α-葡萄糖苷酶抑制率的測定：取50 μL 0.5 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液置于96 孔板中，再分別加入不同質量濃度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、5.0 mg/mL）的大麻素樣品液100 μL，于37 ℃水浴10 min，加入10 mmol/L PNPG 50 μL，再放入37 ℃水浴鍋中加熱10 min，最后使用0.1 mol/L Na2CO3100 μL 終止反應，在酶標儀上于405 nm 處測定吸光度A1；另取100 μL pH 6.8 磷酸鹽緩沖液代替大麻素樣品液測定吸光度A2；為消除反應體系干擾，在不加α-葡萄糖苷酶溶液條件下分別測定只加入大麻素樣品液反應體系的吸光度A3和只加入磷酸鹽緩沖溶液反應體系的吸光度A4。IC50值是通過不同質量濃度大麻素樣品液對α-葡萄糖苷酶抑制率的計算而得。

α-淀粉酶抑制率的測定：取50 μL 0.5 U/mL的α-淀粉酶液溶液置于96 孔板中，再分別加入不同質量濃度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、5.0 mg/mL）的大麻素樣品液100 μL，放入37 ℃水浴鍋中10 min，加入w=0.2%淀粉溶液50 μL，再次37 ℃水浴10 min 后，使用顯色劑（5 mmol/L I2和5 mmol/L KI 溶于1 mol/L HCl）100 μL 終止反應，在酶標儀上于620 nm 處測定吸光度A1；另取100 μL pH 6.8 磷酸鹽緩沖液代替大麻素樣品液，測定吸光度A2；再測定只有大麻素樣品液反應體系的吸光度A3和只有磷酸鹽緩沖溶液反應體系的吸光度A4。IC50值是通過不同質量濃度大麻素樣品液對α-淀粉酶抑制率的計算而得。

每組試驗3次平行，公式如下

式中A1為樣品組吸光度，A2為樣品空白組吸光度，A3為樣品對照組吸光度，A4為空白對照組吸光度。

1.3.6 大麻素類體外降血脂功能的研究 膽酸鹽結合能力的測定：準確吸取1 mL 大麻素樣品液于試管中，依次加入1 mL 10 mg/mL 胃蛋白酶（以pH 6.3 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制），3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，模擬胃環境，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h；以0.1 mol/L 的NaOH 溶液調節pH 值至6.3，隨后加入4 mL 10 mg/mL 胰蛋白酶，模擬腸道環境，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，加入4 mL 1 mmol/L 膽酸鹽（膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉）消化1 h，8 000 r/min 離心20 min，取上清液，加入6 mLφ=60%的H2SO4于70 ℃水浴20 min，取出冰浴5 min 后，在387 nm 處測定吸光度Ae，另取1 mL pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液代替大麻素樣品液，測定吸光度A0；再測定只有大麻素樣品液反應體系并用磷酸緩沖液代替H2SO4的吸光度Ai。IC50值是通過不同質量濃度大麻素樣品液對膽酸鹽結合率的計算而得，平行3次實驗，計算樣品對膽酸鹽結合率［20］計算公式如下

式中A0為樣品空白組吸光度，Ae為樣品組吸光度，Ai為樣品對照組吸光度。

1.4 數據處理與分析

每個處理進行平行3次試驗，結果表示為平均值±標準差。采用Origin、SPSS 軟件對數據進行處理與分析，利用置信度為95%的最小顯著性差異（P<0.05）比較平均值。

2 結果與討論

2.1 提取方法對大麻素浸膏得率影響

圖1（a）～（d）通過漢麻浸膏得率、wCBD、wTHC為評價指標，得到4種提取方法的最佳提取條件。分析圖1（a）可知，大麻素浸膏得率隨著乙醇體積分數的增加而增大，其中無水乙醇制備的大麻素浸膏得率最大，為9.43%，其次是φ=95%乙醇制備的浸膏得率為3.95%。而乙醇/二氯甲烷制備的浸膏得率為3.25%，顯著低于無水乙醇和φ=95%乙醇分別制備浸膏的得率，正己烷和石油醚制備的浸膏得率效果更低。漢麻浸膏中wCBD檢測結果表明φ=95% 乙醇制備的浸膏中wCBD最高，值為241.80 mg/g，顯著高于無水乙醇制備的漢麻浸膏wCBD。無水乙醇作為提取溶劑會導致漢麻葉中更多非大麻素類化合物溶出，導致漢麻浸膏量增加，而浸膏中wCBD降低會影響大麻素的純度，不利于后續大麻素類化合物的分離純化和濃縮單元操作，增大工作量和能耗［21］，因此本實驗選取φ=95%乙醇為最佳提取劑。由圖1（b）可知，浸膏得率隨著超聲時間的增加呈現先升高后降低的趨勢，當超聲功率為300 W 時，超聲時間30 min 時浸膏得率達到最大，為10.03%。其次是超聲功率為240 W時，超聲時間為25 min 浸膏得率較大為8.68%。當超聲功率為180 W 時，超聲時間為30 min 浸膏得率為7.75%，顯著低于前兩種條件浸膏得率。當超聲功率為300 W，超聲時間25 min時浸膏得率7.06%，但是大麻素浸膏中wCBD檢測值為283.04 mg/g，顯著高于超聲功率為300 W，超聲時間30 min 時大麻素浸膏wCBD。隨著超聲功率的增大，細胞的破碎程度變大，但是過大的超聲功率會使大麻素類化合物被破壞，過多雜質溶出。適宜的超聲時間會使細胞中的物質更好地溶出，如果時間過長或過短都會對大麻素有影響［22-23］。經過各方面考慮，選用超聲功率300 W、超聲時間25 min作為超聲提取最佳條件。

圖1（c）實驗結果表明，隨著酶解時間延長得率逐漸增大，直到1 h 達到最大，隨后逐漸降低。經過纖維素酶和果膠酶處理的樣品，酶解1 h 其浸膏得率最大分別為19.90%、19.98%，這是因為纖維素酶和果膠酶破壞了植物細胞壁組織，從而讓溶劑更好地滲入組織內部［24］，進而提高大麻素的提取。并且這兩種酶的效果差異性不顯著，這表明漢麻葉細胞壁主要成分是纖維素和果膠。纖維素與果膠進行復合酶解1 h，其浸膏得率達到了21.11%，浸膏中wCBD檢測值最高為w=24.98 mg/g，其效果明顯優于單一酶，選用復合酶酶解時間1 h作為酶輔助提取法提取最佳條件。如圖1（d）所示，在4個速率條件下，浸膏得率隨時間的增加而先升高后降低。高剪切速率為16 000 r/min 時，高剪切時間90 s 時，浸膏得率達到最大值7.5%，其次高剪切速率為14 000 r/min 時間120 s 時浸膏得率為7.25%，而高剪切速率為14 000 r/min 時間130 s 時浸膏得率為6.93%，這是由于相同速率條件下高剪切時間過長對目標物具有破壞性。高剪切速率14 000 r/min、高剪切時間60 s 時浸膏得率為3.00%，顯著低于其他條件下浸膏得率，但漢麻浸膏中wCBD檢測值最大為161.46 mg/g。在設定的剪切頻率范圍內，隨著剪切頻率增大，機械剪切效應增大，氣蝕作用增強，導致非大麻素類物質的溶出［25］。因此，選用高剪切速率14 000 r/min、高剪切時間60 s作為高剪切提取最佳條件。

圖1 不同提取方法對浸膏得率的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the yield of extract

2.2 HPLC 法測定不同提取方法樣品中的CBD 和THC的含量

4 種提取方法的漢麻中大麻素含量結果見表1所示，通過4種樣品高效液相色譜圖進行比對。由表1可知，對于大麻素，超聲波輔助提取法可以得到最高含量，且與其他3 種方法有顯著差異（P<0.05），其中超聲波輔助提取法wCBD最大，其值為（283.04±16.63）mg/g，其次是溶劑提取法與高剪切輔助提取法，而酶輔助提取法wCBD最低，其值僅為（24.98±3.24）mg/g。超聲技術由于具有機械效應、空化效應和熱效應，通過增大分子的運動速度與穿透力來增加提取效果［26］。而高剪切技術由于轉子高速旋轉產生強烈的剪切力和離心擠壓力等機械作用，使漢麻葉組織細胞發生變形，細胞壁破裂，加速細胞內物質溶出，雖提高了提取效果［27］，但是也對大麻素造成部分破壞。采用溶劑提取法直接提取，獲得wCBD也比較好，但耗費時間長，不能夠快速提取大麻素。通過上述4種方法處理后發現，易使人致幻成癮的THC 完全被去除，為以后漢麻葉的食品、藥品等應用提供科學的依據。

表1 不同提取方法下浸膏中wCBD和wTHC測定結果1）Table 1 Determination results of CBD and THC content in extract with different extraction methods mg/g

2.3 液相-質譜聯用對提取方法萃取物成分分析

2.3.1 UPLC-Q Exactive Focus MS/MS 分析結果采用UPLC-Q Exactive Focus MS/MS 超高效液相高分辨質譜聯用儀對漢麻葉提取物進行成分分析，所得到的總離子流質譜圖如圖2。按照上述數據處理方法對漢麻葉中的大麻素類化合物進行結構推測和確證。目標物存在較多的同分異構體，主要通過質譜裂解方式的不同進行區分。依據化合物的高分辨質譜數據，結合自建數據庫等多個數據庫比對，12 種物質結合質子分子，總結了準確的相對分子質量、保留時間、分子式和二級碎片，具體鑒定結果見表2。

表2 漢麻葉大麻素類成分鑒定1）Table 2 Identification of cannabinoids in hemp leaves

圖2 漢麻葉4種方法提取物總離子流質譜圖（TIC）Fig. 2 Total ion mass spectrometry of hemp leaves extracted by four methods(TIC)

2.3.2 大麻素類化合物成分鑒定 研究共分析鑒定了12 種大麻素類化合物，以含量較多的大麻二酚和大麻色烯為例，二者互為同分異構體。大麻二酚MS1譜圖中顯示該化合物的準分子離子峰為m/z314.224 5［M-H］-，可以作為大麻素類化合物的特征離子，特征離子進一步失去1個H 形成，其分子式C21H30O2，相對分子質量為314.224 1，能夠很好地吻合。MS2圖譜給出主要的碎片離子分別為m/z137.094 9，179.105 7，173.095 5，158.072 1，205.122 1，311.200 4。大麻色烯MS1譜圖中顯示該化合物的準分子離子峰為m/z314.224 5［M-H］-，可以作為大麻素類化合物的特征離子，特征離子進一步失去1 個H 形成，其分子式C21H30O2，相對分子質量為314.224 1，能夠很好地吻合。MS2圖譜給出主要的碎片離子分別為m/z191.106 1，163.075 2，136.051 1，136.052 9，191.107 7，193.122 3。利用液相色譜質譜聯用技術，Gul等［28］對大麻根中的10種大麻素類化合物，包括大麻色烯、Δ8-四氫大麻酚、大麻酚、大麻二酚等，進行了定量分析。Christinat 等［29］采用氣相色譜質譜聯用法，對大麻類食品中15 種大麻素類成分的含量進行了測定，包括大麻二酚、大麻萜酚、Δ9-四氫大麻酚等。

2.4 不同提取方法對大麻素的體外降血糖影響

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶在糖類消化以及吸收中發揮著重要的作用，可抑制酶的活性、降低機體的血糖和血脂水平、防止餐后高血糖的發生，對2型糖尿病的預防及治療具有積極作用［30］。

不同提取方法獲得的大麻素浸膏對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力如圖3 所示，4 種提取方法都呈現隨樣品濃度增大，抑制能力逐漸上升的趨勢。浸膏質量濃度為0～2 mg/mL 時，4 種提取方法的抑制率快速增加，2 ～5 mg/mL 時抑制率增長緩慢。如圖3（a）所示，在質量濃度為5 mg/mL 時，溶劑提取法對α-葡萄糖苷酶抑制率最強，為92.85%，其次是酶輔助提取法、超聲波輔助提取法和高剪切輔助提取法， 分別為85.38%、77.78%、72.22%。溶劑提取法對原料無機械作用與高速剪切破壞，并且沒有酶作用產生大量雜質，因此對α-葡萄糖苷酶抑制能力最好，對漢麻葉分子結構破壞程度較小。如圖3（c）所示，通過軟件計算α-葡萄糖苷酶的半抑制質量濃度分別為酶輔助提取法1.39 mg/mL、高剪切輔助提取法1.37 mg/mL、超聲波輔助提取法0.20 mg/mL、溶劑提取法0.19 mg/mL，超聲波輔助提取法與溶劑提取法之間差異不顯著（P>0.05），超聲波輔助提取法與酶輔助提取法和高剪切輔助提取法之間差異顯著（P<0.05），酶輔助提取法與高剪切輔助提取法之間差異不顯著（P>0.05）。分析圖3（b）實驗結果可知，當浸膏質量濃度為2 mg/mL 時，4 種提取方法制備大麻素浸膏對淀粉酶的抑制能力不同，其中高剪切輔助提取法抑制率為77.48%，溶劑提取法為71.51%，其次是超聲波輔助提取法64.58%，酶輔助提取法抑制率最小37.57%。當浸膏質量濃度為5 mg/mL時，其對α-淀粉酶的抑制能力與質量濃度為2 mg/mL時抑制能力相同，高剪切輔助提取法具有最大的α-淀粉酶抑制能力，為88.22%，酶輔助提取法具有最小的抑制率為56.32%。不同提取方法的大麻素降血糖能力存在差異，這可能與大麻素類化合物中其他成分相關。見圖3（c）可知，4 種提取方法的大麻素浸膏對α-淀粉酶抑制率IC50值由大到小為：酶輔助提取法為3.44 mg/mL、超聲波輔助提取法為0.50 mg/mL、高剪切輔助提取法為0.21 mg/mL、溶劑提取法為0.13 mg/mL，高剪切輔助提取法與溶劑提取法之間的差異不顯著（P>0.05），而酶輔助提取法與超聲波輔助提取法之間存在顯著性差異（P<0.05）。

圖3 不同提取方法對大麻素的體外降血糖影響Fig. 3 Effects of different extraction methods on the hypoglycemic effect of cannabinoids in vitro

2.5 不同提取方法對大麻素的體外降血脂影響

分別采用溶劑提取法、酶輔助提取法、超聲波輔助與高剪切輔助提取法制備大麻素，按照方法1.3.6，吸附結合膽酸鹽，并比較分析4 種不同提取方法獲得大麻素結合甘氨膽酸鈉、膽酸鈉、牛磺膽酸鈉的差異。

由圖4 可見，4 種方法提取的大麻素結合3 種膽酸鹽能力其結合量和質量濃度之間呈明顯的劑量效應關系，隨著質量濃度的增加其結合量逐漸上升。由圖4（a）所示，在浸膏質量濃度為15 mg/mL 時，除超聲波輔助提取法其他3 種提取方法結合率變化較小，溶劑提取法與甘氨膽酸鈉結合率最大為82.41%。當浸膏質量濃度為20 mg/mL 時，超聲提取技術獲得的大麻素能力最強為87.09%，降血脂功能最顯著，其次溶劑提取法抑制率為83.18%、高剪切輔助提取法抑制率為67.82%、酶輔助提取法抑制率為36.64%。說明超聲技術能促進大麻素的溶出，增強與甘氨膽酸鈉的結合，加快甘氨膽酸鈉在腸肝中的循環，膽酸鹽排出時會促使肝臟不斷把體內膽固醇轉化成膽酸鹽，促進膽固醇降解代謝，從而起到降血脂的作用［31］。如圖4（d）所示，當浸膏質量濃度達到20 mg/mL，IC50值由大到小分別為酶輔助提取法24.41 mg/mL、高剪切輔助提取法9.31 mg/mL、超聲波輔助提取法8.64 mg/mL、溶劑提取法6.52 mg/mL，酶輔助提取法與溶劑提取法之間存在顯著性差異（P<0.05），高剪切輔助提取法與超聲波輔助提取法之間差異不顯著（P>0.05）。由圖4（b）可見，在15 mg/mL 繼續增加樣品質量濃度，結合率下降，可能是由于浸膏質量濃度過高時，會抑制自身降血脂活性。其中超聲波輔助提取法提取的大麻素對膽酸鈉的結合率最大為88.85%，超聲功率逐漸提高，對細胞壁的破損程度逐漸增大，使大麻素快速溶出，提取率升高，增大與膽酸鈉的結合量，降血脂作用有一定的提升效果［32］。其次溶劑提取法膽酸鈉結合率較大，為86.64%，高剪切輔助提取法為62.79%，酶輔助提取法膽酸鈉結合率最小，為24.32%。如圖4（d）所示，當浸膏質量濃度達到20 mg/mL，大麻素與膽酸鈉結合率IC50值由大到小分別為酶輔助提取法56.58 mg/mL、高剪切輔助提取法11.01 mg/mL、溶劑提取法7.11 mg/mL、超聲波輔助提取法4.88 mg/mL，各組間差異性顯著（P<0.05）。由圖4（c）可見，當浸膏質量濃度為20 mg/mL 時，4 種方法結合率達到最大。高剪切輔助提取法明顯優于其他幾種提取技術，其對牛磺膽酸鈉的結合率為94.48%，主要是因為牛磺膽酸鈉中磺酸基的酸性比膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的羧基更強，在高濃度下更容易離子化，且由于高剪切技術使細胞被迅速破碎，大大減小了有效成分的擴散阻力，大麻素被快速釋放，結合量明顯增強，降血脂效果明顯［33］。其次是溶劑提取法與超聲波輔助提取法對牛磺膽酸鈉的結合率分別為93.63%、73.75%，而酶輔助提取法與牛磺膽酸鈉結合率最低為22.17%，漢麻葉細胞壁被酶解后使大量雜質溶出，破壞大麻素成分，大大降低提取效率，與牛磺膽酸鈉的結合量明顯降低，降血脂功能明顯低于其他3種方法。如圖4（d）所示，當浸膏質量濃度達到最大，牛磺膽酸鈉結合率IC50值由大到小分別為酶輔助提取法32.91 mg/mL、超聲波輔助提取法12.14 mg/mL、溶劑提取法4.83 mg/mL、高剪切輔助提取法3.26 mg/mL，各組間差異性顯著（P<0.05）。

圖4 不同提取方法對大麻素的體外降血脂影響Fig. 4 Effect of different extraction methods on the hypolipemia of cannabinoids in vitro

3 結 論

本文通過溶劑提取法、酶輔助提取法、超聲波輔助與高剪切輔助4種提取方法制備大麻素類成分，結果表明超聲波輔助提取法wCBD最高，為283.04 mg/g；其次是溶劑提取法，為241.80 mg/g；高剪切輔助提取法，為161.46 mg/g；酶輔助提取法最低，為24.98 mg/g。利用UPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析可知超聲波輔助提取法得到的大麻素成分最多，達到8種。體外降血糖、降血脂試驗發現，超聲波輔助提取法提取出的大麻素類成分對α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶都具有較好的抑制能力，且對膽酸鹽結合能力最高。4 種方法對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的最好抑制率分別為92.85%和88.22%；不同方法對甘氨膽酸鈉、膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結合率分別為87.09%、88.85% 和94.48%。研究對4 種提取方法進行比較發現，超聲波輔助提取法獲得的大麻素含量最高，并且都具有較為良好且穩定的降糖降脂功能。因此低成本、高效率的超聲波輔助提取法在漢麻資源開發與應用中具有潛在優勢。