制藥廢水活性污泥中高效異養硝化-好氧反硝化菌分離及特性研究

朱研研 王耀耀 任風芝 馬巖 喬玲 張雪霞 張鵬 王勇軍 張利利

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，石家莊 052165)

隨著醫藥工業迅猛的發展，制藥廢水已成為嚴重的污染源之一。利用單一的處理技術進行制藥廢水的處理有一定的局限性，近年來，國內學者將研究重點放在多種技術的優化組合，核心處理以生物方法為主。而生物法中傳統的厭氧氨氧化工藝菌倍增時間較長，工藝啟動時間長，并且廢水中通常不含亞硝酸鹽，需與短程硝化工藝相結合。而且厭氧氨氧化過程對廢水中的COD比較敏感，COD的存在會滋生大量的異樣菌，與厭氧氨氧化菌競爭。所以僅通過厭氧氨氧化無法同時去除廢水中的氨氮和COD[1]。

近年來，陸續有同時具有異養硝化好氧反硝化作用的微生物被報道。人們最早從脫硫脫氮污水處理系統中發現具有此特殊性能的菌株Thiosphaera pantotropha[2]。異養硝化好氧反硝化與其他生物脫氮法相比具有很大優勢：①可同時去除COD和氨氮，同時在同一個反應器中進行硝化反硝化過程極大節省了占地面積和運行成本[3-4]；②菌體生長速率快，易于在系統中留存；③菌株代謝基質和產物的多樣性，利于與其他菌株共存，應用范圍較廣[5]；④耐有機負荷，耐溶解氧，脫氮效率高[6]。本文從制藥廢水活性污泥中，通過富集篩選出具有高效脫氮能力的異養硝化好氧反硝化優勢菌株，對純化株進行分類鑒定確定歸屬。并根據純化株生理生化特性，培養特征以及制藥廢水的特點，對其進行脫氮性能研究，獲取了最佳菌劑的脫氮條件。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本實驗所獲菌株來自于河北石家莊市華北制藥集團環保處理活性污泥。

1.2 培養基及試劑

1.2.1 培養基

富集培養基：(NH4)2SO40.5 g/L，琥珀酸鈉2.17 g/L，維氏鹽溶液50 mL/L。維氏鹽溶液：K2HPO46.50 g/L，MgSO4·7H2O 2.50 g/L，NaCl 2.50 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO4·H2O 0.04 g/L[7]。

異養硝化培養基：(NH4)2SO40.24 g/L，其他成分與含量同富集培養基[7]。

BTB培養基：(NH4)2SO40.27 g/L，L-天冬酰胺1.00 g/L，0.1%溴百里酚藍酒精溶液5 mL/L，檸檬酸鈉8.50 g/L，KH2PO41.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.00 g/L，CaCl20.20 g/L,FeCl3·6H2O 0.05 g/L，pH7.0～7.3[8]。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，NaC1 5.00 g/L，pH7.0～7.2[8]。

1.2.2 主要試劑及儀器

主要試劑及儀器見表1。

表1 主要試劑及儀器Tab.1 Major reagents and instruments

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

250 mL三角瓶中裝入40 mL富集培養基，121℃滅菌20 min。取4 mL帶活性污泥的制藥廢水轉接入富集培養基中，30℃，220 r/min培養48 h后，從中取4 mL培養液繼續轉接新的滅過菌富集培養基中，30℃，220 r/min繼續培養48 h，期間取樣顯微觀察菌株的生長情況。再從中取4 mL富集培養液轉接新的滅過菌的培養基中，30℃，220 r/min培養24 h。將培養液逐級稀釋，10-4至10-10的稀釋度各取0.1 mL涂布于BTB快速篩選平板上，30℃培養。觀察菌落生長情況，從中挑選不同形態且菌落周圍有藍色暈圈的菌落接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基，30℃培養成熟后甘油保存于-80℃超低溫冰箱中。

1.3.2 菌株分類鑒定

(1)菌株形態及生理生化鑒定 將分離得到的純化株制成菌懸液稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨培養基上，30℃培養24 h，觀察菌落形態特征和顯微特征。采用細菌鑒定方法[9]進行革蘭染色、糖醇發酵、酶反應等試驗。

(2)16 SrRNA 測序及系統發育分析 采用通用基因組提取試劑盒(Solarbio)提取純化株基因組DNA。以通用引物27F(A:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；1492R(B:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)進行16S rRNA擴增。PCR擴增條件：95℃ 5 min，1個循環，95℃1 min，55℃退火1 min,72℃延伸3 min，共30個循環，在72℃后延伸7 min。PCR產物采用DNA回收試劑盒(TaKaRa)回收，與PGEM-T載體連接轉入大腸埃希菌感受態細胞，挑選克隆提質粒，采用EcoRI(TaKaRa)酶切鑒定，陽性克隆送金唯智生物科技有限公司測序。測序結果經過BLAST進行相似性比對，用ClustalX[9]進行同源性分析，MEGA6.0[10]中的neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.3.3 菌株脫氮性能研究及脫氮條件優化

(1)菌株異樣硝化好氧反硝化特性研究 將富集分離獲得的菌株接入牛肉膏蛋白胨培養基中，30℃，220 r/min培養24 h進行活化。以5%接種量，將上述活化菌液轉接入異養硝化培養基中，每250 mL三角瓶裝100 mL培養基，30℃，220 r/min培養，于36 h取樣檢測殘余的氨氮以及NO-3-N和NO-2-N的值。(2)菌株異養硝化好氧反硝化脫氮條件優化 以異樣硝化培養基為基礎，分別考察不同的pH、碳源種類及其含量以及基礎氨氮值等因素對氨氮去除的影響。將富集分離獲得的菌株接入牛肉膏蛋白胨培養基中，30℃，220 r/min培養24 h進行活化。以5%接種量，將上述活化菌液轉接入不同考察因素的培養基中，每250 mL三角瓶裝100 mL培養基，30℃，220 r/min培養，于36 h取樣檢測殘余的氨氮，硝酸鹽和亞硝酸鹽的值。

1.3.4 檢測方法

檢測方法見表2。

表2 指標檢測方法Tab.2 Detection method

2 結果與討論

2.1 異養硝化好氧反硝化菌富集篩選結果

制藥廢水活性污泥經過富集培養，BTB平板藍斑快速篩選，獲得相對藍斑較大且明顯的3株菌，分別命名為PWAS17，PWAS21和PWAS34。

2.2 菌株形態特征及生理生化特征

2.2.1 菌株形態特征(圖1)

圖1 PWAS17、PWAS21和PWAS34 30℃培養24 h顯微形態及單菌落圖片(油鏡觀察，10×100倍)Fig.1 Micrographia and colony picture of PWAS17,PWAS21 and PWAS34 at 30℃ culturing 24 h(oil mirror observation,10×100times)

3株純化菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上30℃培養24 h特征為，PWAS17菌落大小約1 mm，圓形隆起，邊緣整齊，表面光滑透亮。顯微形態短桿，似球狀，不產芽胞。革蘭染色紅色，呈陰性；PWAS21菌落大小為6～7 mm，扁平，表面粗糙，邊緣不規則，灰白色。顯微形態粗桿，單生或鏈狀生。產芽胞，橢圓或柱形，中生或近中生，不膨大。革蘭染色紫色，呈陽性；PWAS34菌落大小約1 mm，圓形隆起，邊緣整齊，表面光滑透亮，顯微形態細長桿狀，不產芽胞。革蘭染色紅色，呈陰性。

2.2.2 3株菌生理生化特性

3株菌生理生化特性見表3。

表3 PWAS17，PWAS21和PWAS34生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of PWAS17,PWAS21,and PWAS34

2.3 16S rRNA基因序列及系統發育分析

對菌株PWAS17、PWAS21和PWAS34測序獲得的部分16S rRNA序列經過BLAST進行相似性比對，用ClustalX[9]進行同源性分析，MEGA6.0[10]中的neighborjoining法構建系統發育樹。如圖2所示。菌株PWAS17與產堿桿菌屬聚為一簇，與水生產堿桿菌Alcaligenes aquatilisLMG 22996同源性達99.58%。菌株PWAS21與Bacillus cereus聚為一簇，與ATCC14579同源性達99.93%。菌株PWAS34與假單胞菌聚為一簇，同斯惠假單胞菌Pseudomonas sihuiensisKCTC 32246同源性最高達99.93%。3株菌分別綜合形態特征和生理生化特征，可確定為PWAS17為水生產堿桿菌(Alcaligenes aquatilis)，PWAS21蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)，PWAS34為斯惠假單胞菌(Pseudomonas sihuiensis)。

圖2 基于16S rRNA基因序列同源性構建的菌株PWAS17，PWAS21和PWAS34系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PWAS17,PWAS21 and PWAS34 based on the sequence homology of 16S rRNA gene

2.4 菌株脫氮性能研究及脫氮條件優化

2.4.1 菌株異養硝化好氧反硝化特性研究

本實驗在異養硝化培養基基礎上，控制基礎NH4+-N值為50.9 mg/L，以葡萄糖控制基礎COD為600 mg/L，考察接種量5%(活化菌液A=0.936)，30℃，220 r/min培養36 h，3株菌去除NH4+-N和COD的能力以及NO-3-N和NO-2-N的積累情況。結果如表4所示。PWAS17，PWAS21和PWAS34的氨氮去除率分別為73.36%、70.90%和76.86%，COD去除率分別47.92%、87.50%和83.33%。NO-3-N含量分別為0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.10 mg/L，NO-2-N含量均為0.01 mg/L。由此可知3株菌均具有去除NH4+-N的能力，同時降解COD，由此可知3株菌具有異養硝化好氧反硝化作用。去除NH4+-N的過程中，幾乎無NO-3-N和NO-2-N的積累。

表4 PWAS17，PWAS21 和PWAS34異養硝化好氧反硝化特性Tab.4 Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification characteristic of three strains

2.4.2 菌株異養硝化好氧反硝化脫氮條件優化

(1)不同pH對氨氮去除的影響 本實驗在異養硝化培養基的基礎上，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，考察pH為5、6、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5和10.0時，30℃，220 r/min培養36 h后3株菌NH4+-N去除率的影響。由圖3可知，3株菌隨著pH的升高有助于NH4+-N的去除，當pH達到9.0時，NH4+-N去除率達到最高。PWAS17達82.36%，PWAS21達75.6%，PWAS34達86.12%。當pH升到9.5后略有往下走的趨勢。綜合分析，確定3株菌去除NH4+-N最優pH為9.0。

圖3 不同pH對3株菌氨氮去除率的影響Fig.3 Effects of pH on the nitrogen removal rate of strain PWAS17、PWAS21 and PWAS34

(2)不同碳源對氨氮去除的影響 本實驗在異養硝化培養基的基礎上，調最優pH為9.0，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，30℃，220 r/min培養36 h后琥珀酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖5種不同碳源對3株菌NH4+-N去除率的影響。由圖4可知，葡萄糖和蔗糖不利于3株菌的NH4+-N去除，乙酸鈉對于PWAS17，PWAS21有促進作用，而對于PWAS34明顯不利于NH4+-N的去除。琥珀酸鈉和檸檬酸鈉均有利于3株菌NH4+-N的去除，尤以檸檬酸鈉最為明顯，3株菌均達到85%以上，綜合成本問題考慮，確定檸檬酸鈉為最優碳源。

圖4 不同碳源對3株菌氨氮去除率的影響Fig.4 Effects of different carbon source on the nitrogen removal rate of strain PWAS17,PWAS21 and PWAS34

(3)碳源不同含量對氨氮去除率的影響 本實驗在異養硝化培養基的基礎上，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，調最優pH為9.0，以檸檬酸鈉為唯一碳源，分別以(W/V)0.05% 、0.08%、0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1%的檸檬酸鈉含量為考察對象，30℃，220 r/min培養36 h后3株菌NH4+-N去除率的影響。由圖5可知，隨著檸檬酸鈉含量的增加，3株菌NH4+-N的去除效率逐漸提升，當含量提高到0.5%～0.8%時達到相對高值，當為0.8%時分別為92.11%、88.64%和92.13%。之后隨著檸檬酸鈉含量的提高，去除率隨之下降。由此，確定最佳碳源量為0.8%。

圖5 不同碳源含量對3株菌氨氮去除率的影響Fig.5 Effects of the content of carbon on the nitrogenremoval rate of strain PWAS17 and PWAS21

(4)基礎NH4+-N濃度對其去除率的影響 本實驗在異養硝化培養基的基礎上，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，調最優pH為9.0，以0.8%檸檬酸鈉為唯一碳源，220 r/min培養72 h，基礎NH4+-N濃度分別為50、100、200、300、400和500 mg/L時對NH4+-N去除率影響。由圖6可知當基礎氨氮濃度在50～500 mg/L范圍內氨氮去除率PWAS17在91.4%上下波動，PWAS21在87.8%上下波動，PWAS34在91.4%上下波動。由此可知，高濃度的基礎氨氮濃度對3株菌的去除氨氮能力沒有明顯的抑制。

圖6 不同基礎氨氮濃度對3株菌氨氮去除率的影響Fig.6 Effects of the content of NH4+-N on the nitrogenremoval rate of strain PWAS17,PWAS21 and PWAS34

2.5 討論

近年來，陸續有同時具有異養硝化好氧反硝化作用的微生物被報道，異養硝化-好氧反硝化 (heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HNAD)菌是一類能夠在有機物存在的條件下將氨氮氧化、在溶解氧存在條件下將亞硝態氮、硝態氮代謝為氮氣的微生物。最早由Robertson和Kuenen[11]首次發現異養硝化好氧反硝化現象并從脫硫脫氮污水中分離到Thiosphaera pantotropha。近年來，越來越多學者從不同環境中分離篩選到異養硝化好氧反硝化菌株用于各種廢水的治理。有報道，研究者從土壤、污水處理反應器海洋等環境中分離到異養硝化好氧反硝化菌株不動桿菌屬、假單胞菌屬、芽胞菌屬以及鹽單胞菌屬等[12]。但關于Pseudomonas sihuiensis和Alcaligenes aquatilis相關報道尚且極少，迄今僅見Hong等[13]于湖泊沉積物表面分離出1株Pseudomonas sihuiensis具有脫氮能力。Alcaligenes aquatilis尚未見報道。本研究是從制藥廢水活性污泥中，通過富集培養，快速篩選出3株具有異養硝化好氧反硝化菌株，綜合菌株培養特征、顯微特征、生理生化特性以及16S rRNA 序列分析，將3株菌初步鑒定為Pseudomonas sihuiensis、Alcaligenes aquatilis和Bacillus cereus。通過對其脫氮性能研究，在去除氨氮過程中同時降解COD，同時幾乎無硝基氮和亞硝基氮的積累，實現了同步硝化反硝化過程。對其去除氨氮部分條件pH、碳源種類以及含量探索。確定最優pH9.0，0.8%檸檬酸鈉為碳源，PWAS17最高達92.1%，PWAS21最高達88.7%，PWAS34最高達92.1%。并考察了基礎氨氮濃度50～500 mg/L之間時對其氨氮去除的影響，由結果可知隨著基礎氨氮濃度的提高，氨氮的去除率并未受到明顯影響，由此斷定3株菌對基礎氨氮濃度具有一定的耐受性。

3 結論

(1)從制藥廢水中分離篩選出3株高效異養硝化好氧反硝化菌株，分別鑒定為PWAS17水生產堿桿菌(Alcaligenes aquatilis)、PWAS21為蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)，PWAS34為斯惠假單胞菌(Pseudomonas sihuiensis)。

(2)3株異養硝化好氧反硝化菌去除氨氮最佳pH為9.0，最佳碳源為檸檬酸鈉，最佳碳源含量為0.8%。脫單能力PWAS17最高達92.1%，PWAS21最高達88.7%，PWAS34最高達92.1%。

(3)3株菌對基礎氨氮濃度具有顯著耐受性，在50～500 mg/L范圍內保持高效脫單能力。在制藥廢水治理方面具有很廣闊的應用前景。