基于病證結合的中藥復方治療糖尿病機制

尚津鋒 李倩楠 劉 欣 崔一然

在全球范圍內，糖尿病患病率和發病率急劇攀升[1-2]。國際糖尿病聯盟2017年數據顯示，全球糖尿病成人患者約4.25億，預計到2045年，可能達到6.29億。由此可見，控制和治療糖尿病刻不容緩。糖尿病，是以高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病，多由不良生活方式如營養過剩、缺乏運動導致。糖尿病患者多表現為多飲、多尿、多食、消瘦、乏力癥狀，久之全身多器官多系統受損[3]。中醫治病運用“辨證論治”的思路，以中醫證候為依據指導臨床合理用藥，達到“病證結合”的目的[4]，中藥復方在預防和治療糖尿病方面已表現出良好療效，但中藥復方治療不同證候疾病的生物學機制難以明確。近年來，分子生物學在中醫藥領域中廣泛使用，這有利于從分子水平上探討和研究中醫藥治療疾病的作用機制[5]。中醫藥整合藥理學研究平臺，一個以大數據為基礎的智能化數據挖掘平臺，具備建立宏觀病證與微觀分子之間關聯的能力，能夠解決病證結合作用機制研究不明的難題[6]。

本研究通過中藥整合藥理學網絡結合文獻查找，在構建方-多靶點-多通路和證-多靶點-多通路的基礎上，篩選出方與病證結合的靶點并進行通路分析，從而探討中藥復方治療糖尿病不同證候機制，以期為中藥治療糖尿病提供實驗依據和參考。

1 資料與方法

1.1 糖尿病治療方劑及對應證候來源

根據臨床療效，小陷胸湯[7-8]、消渴丸[9-10]、玉泉丸[11-12]、杞菊地黃丸[13-14]4個中藥復方在治療糖尿病方面均取得較好的臨床療效。按照“十二五”普通高等教育本科國家級規劃教材、國家衛生健康委員會“十三五”規劃教材、全國高等中醫藥教材《中醫內科學》[15]，查找小陷胸湯、消渴丸、玉泉丸、杞菊地黃丸4個方劑對應的中醫臨床表現，運用“病證結合”的思想，將4種癥狀表型歸納為痰熱互結、肺熱津傷、氣陰兩虛、肝腎陰虛4個證候。相關臨床表現與中醫藥整合藥理學平臺V2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine V2.0, TCMIP V2.0,http://www.tcmip.cn/）中表型英文詞條相匹配。見表1。

表1 糖尿病證候、臨床表現和治療方劑

1.2 糖尿病、證候、方劑靶標獲取

TCMIP V2.0集合HPO、OMIM、TTD、Drugbank等數據庫，在該平臺對糖尿病不同證候臨床表現的相關英文詞條進行檢索，從而獲得證候靶標群[16]。運用TCMIP V2.0檢索小陷胸湯、消渴丸、玉泉丸、杞菊地黃丸組成中藥的靶標以及糖尿病、痰熱互結證、肺熱津傷證、氣陰兩虛證、肝腎陰虛證獲得相關靶點。獲取的病證和方劑靶標由MedChem Studio預測，只保留可靠性分值大于0.8的靶標[17]。

1.3 核心靶標篩選、富集分析和網絡構建

TCMIP V2.0鑲嵌HAPPI等數據庫，通過該平臺的中醫藥關聯網絡挖掘功能模塊獲得核心靶標，流程如下：以連接度（Degree）、介度（Betweenness）和緊密度（Closeness）的中位數為卡值，篩選核心節點網絡中的關鍵節點基因[17]。運用TCMIP V2.0篩選中藥與證候、疾病的核心靶標，并利用DAVID軟件（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）對核心靶標進行基因本體（GO）富集分析和京都基因以及基因組百科全書（KEGG）富集分析。根據P值篩選出排名前20的信號通路進行分析。“中藥-靶標-通路-證候-疾病”關聯網絡圖通過Cytoscape3.8.0軟件進行可視化。

2 結果

2.1 痰熱互結證糖尿病的分子基礎及對應方劑的作用機制

痰熱互結證候有439個靶標。針對此證候，可選用小陷胸湯進行治療。小陷胸湯有514個作用靶標。糖尿病有167個靶點，從而獲得小陷胸湯治療痰熱互結證糖尿病的140個核心靶點。小陷胸湯治療痰熱互結證糖尿病主要涉及cAMP signaling pathway，Insulin resistance，Insulin signaling pathway，Prostate cancer，Hepatitis B，Pathways in cancer，FoxO signaling pathway，Insulin secretion，Adipocytokine signaling pathway，Neurotrophin signaling pathway，mTOR signaling pathway，AMPK signaling pathway，Pancreatic cancer，Glucagon signaling pathway，HTLV-I infection，Regulation of lipolysis in adipocytes，cGMP-PKG signaling pathway，Estrogen signaling pathway，Prolactin signaling pathway，TNF signaling pathway等通路。169個節點、540條邊的“中藥-靶標-通路-證候-疾病”網絡見圖1。

圖1 小陷胸湯治療痰熱互結證糖尿病的核心靶點和通路

2.2 肺熱津傷證糖尿病的分子基礎及對應方劑的作用機制

肺熱津傷證候有326個靶點。玉米須在TCMIP V2.0中無法檢索，故刪去。檢索除玉米須外的其他藥物（包括格列苯脲）獲得消渴丸561個靶標，進而得到161個核心靶點。GO富集和KEGG富集結果顯示，消渴丸治療肺熱津傷證糖尿病主要涉及Hepatitis B，Measles，HTLV-I infection，Pathways in cancer，Prostate cancer，cAMP signaling pathway，Chronic myeloid leukemia，Pancreatic cancer，FoxO signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Apoptosis，Jak-STAT signaling pathway，Toxoplasmosis，Dopaminergic synapse，Glioma，Osteoclast differentiation，Amphetamine addiction，Thyroid hormone signaling pathway等通路。186個節點、771條邊的“中藥-靶標-通路-證候-疾病”網絡見圖2。

圖2 消渴丸治療肺熱津傷證糖尿病的核心靶點和通路

2.3 氣陰兩虛證糖尿病的分子基礎及對應方劑的作用機制

檢索得到氣陰兩虛證候323個靶點。玉泉丸有529個作用靶標。檢索到167個糖尿病靶點，篩選到INS、AVPR2、PIK3CA、PIK3R1等162個核心靶點。對162個核心靶標的GO富集和KEGG富集分析發現，玉泉丸對氣陰兩虛證糖尿病的治療主要涉及Pathways in cancer，Hepatitis B，Prostate cancer，cAMP signaling pathway，Measles，Colorectal cancer，PI3K-Akt signaling pathway，Amphetamine addiction，Circadian entrainment，Thyroid hormone signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Proteoglycans in cancer，Apoptosis，Central carbon metabolism in cancer，FoxO signaling pathway，Estrogen signaling pathway，mTOR signaling pathway，AMPK signaling pathway等通路。182個節點、661條邊的“中藥-靶標-通路-證候-疾病”網絡見圖3。

圖3 玉泉丸治療氣陰兩虛證糖尿病的核心靶點和通路

2.4 肝腎陰虛證糖尿病的分子基礎及對應方劑的作用機制

檢索到625個肝腎虧虛證候靶點。針對此證候，杞菊地黃丸潛在作用靶點有807個。TCMIP V2.0篩選到226個核心靶點。對226個核心靶標進行GO富集和KEGG富集分析發現，杞菊地黃丸治療肝腎陰虛證糖尿病主要涉及的通路包括Pathways in cancer，Prostate cancer，Hepatitis B，Colorectal cancer，Chronic myeloid leukemia，cAMP signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，Pancreatic cancer，Glioma，Prolactin signaling pathway，FoxO signaling pathway，Central carbon metabolism in cancer，Cholinergic synapse，Estrogen signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，Melanoma，Endometrial cancer，Rap1 signaling pathway，Acute myeloid leukemia等。256個節點、927條邊的“中藥-靶標-通路-證候-疾病”網絡見圖4。

圖4 杞菊地黃丸治療肝腎陰虛證糖尿病的核心靶點和通路

3 討論

隨著人民生活水平的提高，糖尿病逐漸成為普遍性疾病。目前，中醫藥在糖尿病治療方面發揮顯著作用。為此，本研究以小陷胸湯等4個方劑為切入點，基于TCMIP V2.0展開“4個方劑，4種證候”的分子生物學研究，從生物信息學角度，揭示中醫藥治療糖尿病的潛在機制，為詮釋傳統中醫藥理論的科學內涵提供依據。中國中醫藥學會糖尿病學會消渴病專業委員會曾提出分期辨證糖尿病的觀點，將糖尿病分為5期：隱匿期，消渴期，并發癥早、中、晚期[18]。糖尿病隱匿期，以陰虛為主要病機，多出現形體肥胖、舌紅脈數等癥狀。在消渴期，肺熱津傷、胃熱熾盛等陰虛化熱的證候表現出來，患者通常出現“三多一少”、舌紅苔薄等癥狀。處于并發癥期的患者臟腑開始不同程度損傷。從病機上看，并發癥早期氣陰兩傷，中期痰瘀互結，晚期氣血陰陽俱衰。呂仁和教授[19]曾將糖尿病分為3個時期：脾癉、消渴、消癉期。最近，仝小林院士[20]提出“分類—分期—分證”思想、“態靶結合”思想，為糖尿病的治療開拓了新的道路。由此可見糖尿病的分期分證治療得到許多醫家認可。早期，痰熱互結，使用小陷胸湯理氣化痰。隨著疾病傳變，患者出現糖尿病經典“三多一少”癥狀，接近中醫所講的“消渴病”，消渴丸可作為主要復方進行治療。中后期，患者開始出現多種并發癥，肺、肝、腎等臟器出現異常，表現出氣陰兩虛和肝腎陰虛的證候，使用玉泉丸和杞菊地黃丸對癥治療。總之，糖尿病以痰、熱、燥、瘀4種病機貫穿始末[21]，不同發病階段表現出不同癥狀，通過辨證論治，針對糖尿病的早期、中期、后期、末期4個階段推薦方劑小陷胸湯、消渴丸、玉泉丸、杞菊地黃丸。

GO富集和KEGG富集結果顯示，小陷胸湯、消渴丸等4個復方治療糖尿病均涉及的通路有7個，分別為 cAMP signaling pathway，FoxO signaling pathway，Pathways in cancer，Prostate cancer，Hepatitis B，Prolactin signaling pathway以及HTLV-I infection。cAMP signaling pathway通過改變腺苷酸環化酶活性調節靶細胞內第二信使cAMP水平，cAMP水平改變可能與糖尿病病程中視網膜代謝紊亂以及腎臟纖維化相關[22-23]；FoxO是一類重要的轉錄因子，抑制該類物質的活性可降低患糖尿病風險，如FoxO1促進葡萄糖-6-磷酸酶等表達導致胰島素耐受，損傷胰島B細胞[24-25]；糖尿病與癌癥關系密切[26]，Pathways in cancer等癌癥通路可能是糖尿病導致腫瘤的機制之一；Hepatitis B通路與糖尿病關系已被驗證，可能機制是乙肝病毒通過損傷肝功能而導致肝臟糖代謝異常并產生胰島素抵抗[27]；實驗表明催乳素體外條件下可抑制高糖誘導的胰島β細胞凋亡，但機制頗有爭議[28]；HTLV-I infection通路的出現提示人類嗜T細胞病毒可能與糖尿病相關。由此說明，提高機體營養物質代謝和能量轉換、抑制癌癥細胞和炎癥因子是治療不同證候糖尿病的基本思路。

小陷胸湯治療痰熱互結型糖尿病的分子通路主要為cAMP signaling pathway,Insulin resistance,Insulin signaling pathway等，作用機制涉及：1）通過胰島素、胰高血糖素、甲狀腺激素等調節血糖水平，并且促進脂肪代謝，相關通路包括Insulin resistance，Insulin secretion，Insulin signaling pathway，FoxO signaling pathway，Glucagon signaling pathway，Regulation of lipolysis in adipocytes等，從而達到降低血糖、減少脂肪堆積的功效，此外，小陷胸湯可能通過AMPK signaling pathway通路促進糖脂分解代謝并減少合成代謝[29]，改善胰島素抵抗。2）提高機體營養物質吸收代謝和能量代謝，兼緩解機體神經系統異常，相關通路包括cAMP signaling pathway，cGMP-PKG signaling pathway，neurotrophin signaling pathway等，這些通路主要對倦怠、脘痞等癥狀有調節作用。3）調節陰陽，扶正祛邪，小陷胸湯可能通過抑制過度免疫反應，糾正失衡的炎癥，抑制相關的癌癥，通路有Hepatitis B，TNF signaling pathway，Prostate cancer，Pathways in cancer，Pancreatic cancer。腫瘤壞死因子（TNF）通過促進炎癥因子釋放來誘導細胞凋亡，其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與胰島素抵抗有密切關系，機制可能與激活NF-κB信號通路，抑制胰島素信號傳導有關，此外，血清TNF-α水平與糖尿病腎病病程成正相關，可能機制在于產生炎癥因子，增加微血管通透性，從而損傷腎小球組織[30-31]；神經營養素通過調節膽堿能遞質，調控細胞凋亡，調節突觸可塑性影響糖尿病腦病，可能機制是由于高血糖高血脂誘發的神經營養素-3（NT-3）分泌減少[32-33]。小陷胸湯治療痰熱互結型糖尿病的分子通路主要涉及激素水平調節、脂肪代謝促進、細胞營養吸收、神經系統異常緩解以及癌癥炎癥抑制。

消渴丸對肺熱津傷證糖尿病發揮治療作用的通路為Hepatitis B，Pathways in cancer，FoxO signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，Jak-STAT signaling pathway等，包括以下3個方面：隨著糖尿病的傳變，大多數核心靶標參與改善機體免疫功能失調和炎癥反應，說明機體已出現細胞因子風暴和炎癥瀑布反應，Osteoclast differentiation激活免疫，除了炎癥感染外，也有癌癥相關通路，如Pancreatic cancer，Prostate cancer等；機體進一步虛弱，其核心基因還參與細胞能量轉化通路cAMP signaling pathway和基本功能通路Apoptosis，Jak-STAT signaling pathway等；此外，通過FoxO signaling pathway參與糖代謝，Thyroid hormone signaling pathway調節甲狀腺激素水平和Dopaminergic synapse調節神經系統等多種途徑降低血糖。其他通路中PI3K-Akt與mTOR信號通路已被證明與胰島β細胞功能相關[34]。PI3K-Akt通路是胰島素的主要下游通路，與葡萄糖代謝有著密切關系，該通路被抑制可引起胰島素抵抗進而發生2型糖尿病[35]。研究顯示，激活PI3K-Akt和mTOR信號通路，顯著增加胰島β細胞的數量和體積，反之促進凋亡[36-37]。故消渴丸治療肺熱津傷證糖尿病的作用機制主要涉及抑制炎癥癌癥因子、提高機體能量轉化和物質代謝、調節激素水平和神經系統。

玉泉丸治療氣陰兩虛型糖尿病的核心靶點富集得到PI3K-Akt signaling pathway，FoxO signaling pathway，mTOR signaling pathway，AMPK signaling pathway等通路，包括以下3個方面：1）癌癥炎癥相關通路，包括Pathways in cancer，Hepatitis B，Prostate cancer，Central carbon metabolism in cancer，Proteoglycans in cancer；2）神經激素調節通路，Circadian entrainment，Thyroid hormone signaling pathway，Estrogen signaling pathway；3）細胞能量物質代謝通路，cAMP signaling pathway，AMPK signaling pathway，Apoptosis，FoxO signaling pathway。玉泉丸治療氣陰兩虛型糖尿病抑制以下過程發揮部分治療作用：腎小球系膜細胞中Jak-STAT通路被高血糖激活，導致腎小球系膜細胞過度增殖；甲狀腺激素分泌異常，過多加速胰島素降解，過少影響糖脂代謝[38]；長期高血糖促進破骨細胞形成，造成骨量減少甚至骨質疏松，從而導致糖尿病骨代謝異常[39]。所以，玉泉丸治療氣陰兩虛型糖尿病的分子機制主要涉及癌癥炎癥抑制、神經和激素調節、能量物質代謝增加。

杞菊地黃丸中山茱萸等藥材通過T cell receptor signaling pathway，Hepatitis B等通路提高免疫功能，抑制炎癥反應，通過Rap1 signaling pathway等通路提高心肺功能，從而達到補益肝腎和回陽救逆的作用。有研究證實，Rap1b可能通過調節線粒體生源基因，從而減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡損傷[40]。同時糖尿病后期患者出現癌癥等并發癥，杞菊地黃丸作用于癌癥相關通路，如Pathways in cancer，Prostate cancer，Colorectal cancer，Central carbon metabolism in cancer。患者在危重期可能出現急性疾病和惡性腫瘤，杞菊地黃丸可能通過Acute myeloid leukemia，Endometrial cancer，Melanoma通路發揮治療作用。因此，杞菊地黃丸主要通過影響Acute myeloid leukemia，Endometrial cancer，Melanoma等惡性腫瘤通路，并作用于T細胞受體治療肝腎陰虛證糖尿病，從而達到抑制重癥癌癥和提高機體免疫能力的功效。

“病證結合”等中醫思維和“態靶結合”的分子生物學理念相結合，是解決目前病證結合作用機制不明確難題的有效路徑。將宏觀的癥狀、總結的證候與微觀的靶標綜合分析，針對疾病進行靶向性治療，從而達到精準治療的目的，為疾病的中藥治療提供了新的思路。本文從“方證對應”切入，采取“病證結合”的思維，探析方劑治療疾病證候的作用機制，詮釋了方劑治療中醫證候的科學內涵，為糖尿病的臨床治療提供參考。