基于Nrf2/Keap1/HO-1通路的淫羊藿素對精索靜脈曲張雄性大鼠生精功能的影響

黃雅平 林文東 丁小明

精索靜脈曲張是目前臨床中較為常見的男科疾病，好發于青壯年，主要指精索內靜脈伸長、擴張、迂曲。有調查結果顯示，精索靜脈曲張的臨床發病率10%～15%，其主要發病部位為左側，約30%以上男性不育癥由精索靜脈曲張誘發[1]。研究表明，精索靜脈曲張是目前臨床中導致患者出現附睪及睪丸功能障礙的主要因素，并可能誘發患者出現生精功能異常[2]。依照傳統中醫理論，精索靜脈曲張性不育癥患者常采用補腎祛瘀法進行治療，精索靜脈曲張致不育癥主要與腎虛血瘀關系密切，導致患者出現腎精虧虛、營氣不從[3]。淫羊藿是目前廣泛應用的補腎藥，其應用歷史悠久，又稱為仙靈脾，現代藥理學研究表明其具有明確的抗腫瘤、抗衰老作用。淫羊藿能有效促進睪丸分泌睪酮，在促進小鼠精囊及附睪發育中發揮重要作用，具有明確的性激素樣效應，可作為治療精索靜脈曲張的潛在藥物[4]。本研究通過構建雄性大鼠精索靜脈曲張動物模型，并對該模型進行研究，分析基于Nrf2/Keap1/HO-1通路淫羊藿素對精索靜脈曲張雄性大鼠生精功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇青春期SPF級雄性大鼠60只作為研究對象，大鼠體重（170±10）g，6周齡，所有大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于泉州醫學高等專科學校屏障系統動物房，許可證號SYXK（閩）2016-0001。所有大鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、模型組、陽性對照組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。按實驗要求先進行適應性飼養，再進行后續實驗。飲食飲水一切按要求正常給予。

1.2 造模方法

本研究中模型組、陽性對照組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組均構建精索靜脈曲張大鼠模型，采用左腎靜脈部分結扎法構建模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，隨后于下腹部正中切開皮膚，打開腹腔，充分暴露精索內靜脈、左側腎靜脈、下腔靜脈及腎上腺靜脈。將大鼠腎上腺靜脈內側部分左腎靜脈段和左側精索靜脈仔細游離并使用4-0絲線穿過并備用，使用0.65 mm光滑金屬桿與該段左腎靜脈上平行結扎，結扎完成后小心拔出金屬桿，復通靜脈構建左腎靜脈狹窄模型，后分離并結扎左髂總靜脈與精索內靜脈間交通支，后關腹縫合切口。空白對照組使用假手術方案處理，參照模型組進行分離靜脈但不做結扎處理，其他操作同模型組。術后6周麻醉大鼠，再次開腹觀察大鼠精索內靜脈及雙腎狀態，較右側精索內靜脈左側明顯擴張迂曲且左腎無萎縮。模型制備不成功大鼠則清除出實驗，最終模型組、陽性對照組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組每組入組8只大鼠。所有大鼠均適應性喂養一周后開始給藥治療。

1.3 干預方法

空白對照組、模型組按實驗方案灌胃（2 ml/d），低劑量組、中劑量組、高劑量組分別淫羊藿素灌胃75 mg/kg、100 mg/kg和125 mg/kg，淫羊藿素為淺黃色粉末，購自西安小草植物科技有限公司，陽性對照組采用邁之靈片（德國禮達大藥廠，注冊證號ZJ20140002）54 mg/kg灌胃治療，各組大鼠每日灌胃干預一次，持續給藥干預8周后再進行后續操作。

1.4 觀察指標

各組均給藥8周后處死大鼠，摘取大鼠左側睪丸、附睪，稱重并計算臟器指數，檢測精子濃度、總活率、前向運動精子、精子頭側擺幅度（ALH）、精子曲線速度（VCL）、精子直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）；檢測左側附睪生精細胞凋亡情況，大鼠睪丸組織超氧化物酶歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH-X）及丙二醛（MDA）水平，Western Blot檢測睪丸組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達，逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測睪丸組織中Nrf2、Keap1和HO-1的mRNA表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示行方差檢驗分析，利用LSD-t檢驗分析兩組間計量資料差異，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左側睪丸及附睪指數

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠睪丸指數及附睪指數明顯高于模型組（P＜0.05），陽性對照組和淫羊藿素低、中、高三組睪丸指數、附睪指數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 6組大鼠左側睪丸及附睪指數比較(mg/g,±s)

表1 6組大鼠左側睪丸及附睪指數比較(mg/g,±s)

組別 只數 睪丸指數 附睪指數空白對照組 10 3.86±0.21 1.51±0.11模型組 8 3.02±0.12 1.08±0.07陽性對照組 8 3.74±0.17 1.40±0.05低劑量組 8 3.61±0.15 1.31±0.08中劑量組 8 3.73±0.09 1.42±0.06高劑量組 8 3.76±0.13 1.41±0.07

2.2 精子活動度

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠精子濃度、總活率、前向運動精子、ALH、VCL、VSL及VAP明顯高于模型組（P＜0.05），陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠精子濃度、總活率、前向運動精子、ALH、VCL、VSL及VAP比較差異無統計學意義（P＞0.05），低劑量組大鼠精子濃度、總活率、前向運動精子、ALH、VCL、VSL及VAP略低于陽性對照組、中劑量組、高劑量組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 6組大鼠精子活動度比較(±s)

表2 6組大鼠精子活動度比較(±s)

組別 只數 精子濃度(M/ml)總活率(%)前向運動精子(%)VSL(mm/s)VCL(mm/s)VAP(mm/s)ALH(mm/s)空白對照組 10 81.74±4.59 70.84±5.02 52.38±4.58 29.64±1.03 49.54±3.92 40.65±2.38 2.31±0.34模型組 8 54.39±4.11 45.74±4.57 20.12±5.01 10.31±2.01 27.43±3.84 17.21±3.12 1.23±0.29陽性對照組 8 66.49±3.98 62.38±4.88 40.84±4.43 26.48±1.88 42.48±2.19 36.73±2.99 2.08±0.27低劑量組 8 61.92±5.02 58.34±5.12 38.49±5.12 23.31±1.73 39.28±2.99 34.01±2.74 1.93±0.30中劑量組 8 67.39±4.38 61.21±4.92 41.21±5.03 25.49±1.69 41.99±3.01 36.04±3.41 2.03±0.33高劑量組 8 68.41±4.47 62.19±4.79 42.19±5.47 26.03±1.64 42.84±2.74 37.03±2.55 2.17±0.28

2.3 左側附睪生精細胞凋亡情況

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠附睪生精細胞凋亡指數明顯低于模型組（P＜0.05），陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠附睪生精細胞凋亡指數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 6組大鼠左側附睪生精細胞凋亡情況比較(±s)

表3 6組大鼠左側附睪生精細胞凋亡情況比較(±s)

組別 只數 附睪生精細胞凋亡指數空白對照組 10 1.54±0.32模型組 8 12.47±1.02陽性對照組 8 2.70±0.28低劑量組 8 3.28±0.19中劑量組 8 2.74±0.24高劑量組 8 2.56±0.21

2.4 睪丸組織指標檢測結果

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠SOD、LDH-X明顯高于模型組，MDA明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠SOD、LDH-X、MDA比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 6組大鼠睪丸組織指標檢測結果(U/L,±s)

表4 6組大鼠睪丸組織指標檢測結果(U/L,±s)

組別 只數 LDH-X SOD MDA空白對照組 10 75.85±4.39 96.04±5.43 7.84±1.29模型組 8 43.92±3.99 63.29±7.65 19.68±4.30陽性對照組 8 67.48±5.01 90.09±4.95 8.79±3.88低劑量組 8 65.37±4.38 87.94±5.01 9.32±4.19中劑量組 8 67.01±4.25 89.99±4.83 8.92±4.27高劑量組 8 68.74±3.49 91.32±4.94 8.57±3.94

2.5 Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達水平檢測結果

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白顯著高于模型組（P＜0.05），陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達水平檢測結果(±s)

表5 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達水平檢測結果(±s)

組別 只數 Nrf2/β-actin Keap1/β-actin HO-1/β-actin空白對照組 10 0.67±0.09 0.65±0.08 0.78±0.06模型組 8 0.20±0.04 0.24±0.03 0.31±0.04陽性對照組 8 0.61±0.10 0.63±0.09 0.71±0.05低劑量組 8 0.55±0.07 0.56±0.08 0.66±0.08中劑量組 8 0.59±0.08 0.60±0.09 0.70±0.06高劑量組 8 0.62±0.06 0.64±0.07 0.72±0.07

2.6 Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表達水平檢測結果

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA明顯高于模型組（P＜0.05），陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表達水平檢測結果(±s)

表6 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表達水平檢測結果(±s)

組別 只數 Nrf2/β-actin Keap1/β-actin HO-1/β-actin空白對照組 10 0.56±0.04 0.67±0.08 0.78±0.12模型組 8 0.21±0.06 0.28±0.05 0.36±0.07陽性對照組 8 0.53±0.04 0.58±0.06 0.66±0.10低劑量組 8 0.46±0.03 0.50±0.07 0.61±0.11中劑量組 8 0.51±0.05 0.57±0.07 0.65±0.12高劑量組 8 0.55±0.04 0.61±0.10 0.71±0.13

3 討論

精索靜脈曲張是目前臨床中導致男性出現不育癥的重要病因，且WHO最新數據顯示其已成為導致男性不育的主要誘因[5]。有學者提出的一種構建方案是縮窄大鼠左側精索靜脈匯入左腎靜脈處，是目前成功率高的動物模型，在基礎研究中得以廣泛應用，為男性不育癥的研究提供了實驗依據[6]。還有學者[7-8]指出，利用縮窄大鼠左側精索靜脈匯入左腎靜脈處的方案進行干預發現，左側附睪組織出現較明顯病變狀態，精子數量明顯減少，且排列紊亂。而且大部分生理細胞內還存在空泡情況，消融和固縮現象等，出現亞細胞結構消失，如細胞膜、細胞核、線粒體、內質網及溶酶體消失，同樣的情況還在生精細胞中出現。結果表明采用縮窄大鼠左側精索靜脈匯入左腎靜脈處的方案可造成大鼠附睪組織損傷，因此本研究擬選擇該模型進行后續研究。

淫羊藿是目前廣泛應用的傳統壯陽補腎中藥，也是目前生殖內分泌疾病的中醫中藥治療中常用藥物[9]。淫羊藿具有補腰膝、益精氣、堅筋骨、強心力功效，并具有較強的抗氧化作用。研究表明，采用生精素片等含淫羊藿中藥制劑治療137例精索靜脈曲張誘發的生精功能異常患者，患者治療一年半內受孕率達60%以上[10]。研究表明，幼年小鼠采用淫羊藿干預會顯著調節其生殖內分泌功能，有效促進幼年小鼠附睪及精囊的發育[11]。利用淫羊藿干預可有效調節大鼠睪丸內睪酮合成及分泌，改善睪丸生精功能，并具有明確的性激素樣效應，也成為目前治療男性不育的新選擇。精索靜脈曲張的發病和發展機制復雜，研究認為其主要與氧化應激導致細胞凋亡、炎癥等有關，其中生精細胞凋亡是目前公認的導致男性不育的細胞學基礎[12]。

陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠睪丸指數、附睪指數、精子濃度、總活率、前向運動精子、ALH、VCL、VSL、VAP及SOD、LDH-X明顯高于模型組，生精細胞凋亡指數、MDA明顯低于模型組。進一步分析各組大鼠組織Nrf2/Keap1/HO-1通路研究結果顯示，陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白及mRNA明顯高于模型組。邁之靈片是目前臨床常用的治療精索靜脈曲張的藥物之一，其具有增加靜脈回流，降低血管通透性，增加血管彈性和張力，減輕靜脈淤血癥狀和抗氧自由基的作用，因此本研究選擇該藥物作為陽性對照藥，用于評估淫羊藿素的臨床應用潛在價值。低、中、高劑量組與陽性對照組各指標無明顯差異，表明淫羊藿素具有較高的改善精索靜脈曲張雄性大鼠生精功能療效。分析認為，Nrf2在細胞可與胞質內特異性受體Keap1結合，并失去活性[13]。HO-1體內可催化血紅素生成CO、鐵及膽紅素，也是重要的調控基因[14]。

綜上所述，采用淫羊藿素治療精索靜脈曲張，可能通過調控Nrf2/Keap1/HO-1通路有效調節雄性大鼠生精功能。