針刺對慢性偏頭痛大鼠趨化因子C-C配體2和C-X-C基序配體1的影響研究

周夢荻 孫銘聲 劉 一 鄭宇琦 蔡定均 趙 凌

(成都中醫藥大學，成都，610075)

偏頭痛是一種常見的中樞神經系統疾病，其病情特征為反復發作、一側或雙側搏動性的頭痛[1]。偏頭痛根據發作頻率可分為發作性偏頭痛和慢性偏頭痛，其中每年有大約2.5%的發作性偏頭痛進展為慢性偏頭痛[2]。與發作性偏頭痛比較，慢性偏頭痛致殘率更高，并導致更多的疾病負擔。目前，慢性偏頭痛發展的生理學機制還不完全清楚。有證據表明炎癥和三叉神經血管系統在發病中起著至關重要的作用[3]。三叉神經血管通路將傷害性信息從腦膜傳遞到大腦，三叉神經脊束核尾側亞核(Spinal Trigeminal Nucleus Caudalis,Sp5C)是三叉神經血管通路傳遞腦膜傷害性信息的重要部位[4]。有學者認為，三叉血管中的無菌性神經源性炎癥是慢性偏頭痛發病的關鍵病理環節，中樞性炎癥也被認為是慢性偏頭痛的主要病因。

慢性偏頭痛作為慢性疼痛的一種，受到了國內外研究的關注，有關慢性疼痛研究的一個重要進展表明，神經炎癥反應是慢性疼痛產生和持續的重要因素[5]。偏頭痛中的神經源性炎癥主要以三叉神經釋放神經肽如降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene-Related Peptide，CGRP)和P物質為特征，導致動脈血管擴張、血漿蛋白外滲和肥大細胞脫粒，炎癥介質或趨化因子可能參與了這一系列反應[6]。趨化因子是一類小分子蛋白，其相對分子質量約為8～14 kDa，當機體發生炎癥、損傷及病原體入侵時，其表達水平增高，可以通過誘導神經炎癥反應而導致神經性疼痛和炎癥疼痛的發展[7]。其中，趨化因子單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)，又稱為趨化因子C-C配體2[Chemokine(C-C Motif) Ligand 2，CCL2]，是介導炎癥反應的一種重要因子，也被認為是一種新的致痛因子[8]。有學者報道了家族性偏癱偏頭痛小鼠模型的三叉神經節中單核細胞趨化蛋白(Monocyte Chemotactic Protein-1，MCP-1)的mRNA和蛋白水平較高；并且他們還報道了偏頭痛患者血漿中MCP-1水平升高[9-11]。此外，趨化因子C-X-C基序配體1[Chemokine(C-X-C Motif) Ligand 1]也在維持慢性炎癥疼痛中發揮重要作用[12]。在一項研究中也發現，偏頭痛患者血清中的CXCL1有明顯的升高，CXCL1也是一種炎癥介質以及細胞傷害性因子[13]。最新的研究也發現多種趨化因子在偏頭痛動物模型中有所表達[14]。

針灸作為一種傳統的非藥物療法，已被偏頭痛臨床實踐指南作為推薦方案廣泛應用于臨床[15]。大量臨床研究證明針刺治療慢性偏頭痛的療效具有操作簡單方便、療效持久、無不良事件等特點[16]。目前，在國內外的研究中發現，針刺治療偏頭痛多選用少陽經穴且效果顯著[17]。為進一步探究針灸治療偏頭痛的機制，本研究通過制備慢性偏頭痛大鼠模型，觀察針刺對Sp5C中趨化因子CCL2以及CXCL1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量200～240 g，由成都恩斯維爾生物科技有限公司的實驗動物中心提供，生產合格證號：SCXK(湘)2019-0004。大鼠在標準條件下(溫度：22～25 ℃，相對濕度：45%～65%，12 h光照到黑暗周期，隨意進食和飲水)被飼養在成都中醫藥大學實驗動物中心。經過1周適應期，進行分組及造模。實驗遵照科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。實驗方案經成都中醫藥大學倫理委員會批準(倫理編號：2019-23)。

1.1.2 藥物 硝酸甘油注射液(Nitroglycerin，NTG)(北京益民醫藥有限公司，國藥準字H11020289)。

1.1.3 試劑與儀器 華佗牌一次性無菌針灸針0.18 mm×13 mm(蘇州華佗醫療用品有限公司，批號：222012)，電子Von Frey測痛儀(IITC Life Science Inc，美國，型號：BW-EVF2393)，大鼠MCP-1酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)藥盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：JM-01506R1)，大鼠CXCL1 ELISA藥盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：JM-10942R1)，酶標儀(Diatek公司，型號：DR-200Bs)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法將大鼠隨機分配為4組：對照組(Cont)，模型組(NTG)，針刺組(ACU)，非經非穴組(Sham ACU)，每組7只。參照Chen等[18]的報道：造模方式采用硝酸甘油頸背部皮下注射。以10 mg/kg的劑量在第1、3、5、7、9天，對模型組、針刺組、非經非穴組大鼠進行頸背部皮下注射。注射時間為上午，對照組以10 mg/kg的劑量頸背部皮下注射生理鹽水。造模成功標準：大鼠出現頻繁撓頭、爬籠等偏頭痛樣行為學現象且大鼠足底機械痛閾明顯降低[18]。

1.2.2 干預方法 對大鼠進行針刺治療，首先抓取捆綁固定。針刺組選取雙側“率谷”(位于耳郭尖上方與頂骨結節連線的中點)、“陽陵泉”(后三里上外側5 mm處)進行針刺干預。取穴標準參照鄧春雷等主編的《實驗針灸學》以及《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠》[19-20]。率谷穴沿皮刺、陽陵泉直刺，進針后行小幅度捻轉，予以平補平瀉，頻率為120次/min，持續捻轉1 min后，每5分鐘行針1次，留針20 min。非經非穴組取大鼠軀干上非穴點Ⅰ(髂棘上10 mm，后正中線旁開20 mm處)、非穴點Ⅱ(髂后上棘止點，肌肉豐厚處)進行針刺干預，留針20 min。模型組、對照組除捆綁固定外不做其余干預。連續干預9 d。

1.2.3 機械痛閾值測定 采用電子Von Frey儀器，于第1天造模前2 h測定，之后在每次NTG注射造模后2 h測定。首先校準儀器誤差，同時將大鼠放入懸空的網格箱中，使其適應環境5～10 min。大鼠安靜后，將儀器讀數歸零，采用探針自下而上垂直刺激大鼠左后爪或右后爪的中央(無肉墊位置)，逐漸增加壓力，直至觀察到大鼠出現明確的疼痛反應，如縮足、抬足、舔舐刺激部位、跳起等，為陽性反應。移開探針，儀器自動記錄下數值。測定痛閾時，每只大鼠重復測量5次，然后對最接近5次測量值中位數的3個數值取平均值，得到機械痛閾值。

1.2.4 ELISA 在第9天對大鼠干預完成后，用2%的戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取出Sp5C，放入-80 ℃冰箱保存備用。對組織進行研磨勻漿后，取上清液，嚴格按照ELISA藥盒說明書進行測定。

2 結果

2.1 大鼠足底機械痛閾比較 各組大鼠在第1天造模前，足底機械痛閾組間差異無統計學意義(P>0.05)。第3天注射NTG造模后，模型組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；針刺組痛閾下降較為緩慢。第5天注射NTG后，模型組痛閾持續降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；針刺組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，針刺組與非經非穴組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。第7天注射NTG后，模型組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；模型組與針刺組比較差異有統計學意義(P<0.01)；針刺組與非經非穴組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。在第9天最后一次注射NTG后，模型組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.001)，針刺組痛閾與模型組比較持續升高(P<0.001)；針刺組與非經非穴組比較，差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間足底機械痛閾比較

2.2 各組大鼠Sp5C的趨化因子水平的比較 與對照組比較，模型組的Sp5C中CCL2、CXCL1水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)。針刺組的趨化因子CCL2的水平與模型組比較顯著下降(P<0.01)，CXCL1也呈下降趨勢(P<0.05)。然而針刺組與非經非穴組之間趨化因子水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠趨化因子CCL2、CXCL1水平的比較

3 討論

偏頭痛是一種常見的慢性神經血管性疾病，其病情具有反復發作、纏綿難愈以及致殘性高的特征。三叉神經血管系統的激活及敏化是偏頭痛發生的病理生理基礎，其中神經源性炎癥是其關鍵環節。硝酸甘油作為一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的供體具有很強的揮發性，NO分子小可以穿過血腦屏障[21]，可以引起顱內腦膜血管(顱內痛敏結構)持續地擴張從而誘發搏動樣頭痛。已有多項報道研究表明多次間隔的頸背部皮下注射NTG會導致大鼠偏頭痛樣行為及敏化痛覺反應[22]。本研究結果顯示，采用頸背部NTG皮下注射可以成功復制慢性偏頭痛模型，使偏頭痛大鼠產生痛覺過敏。針刺可以改善慢性偏頭痛大鼠的疼痛閾值，緩解痛覺過敏，并且可以降低大鼠Sp5C中趨化因子CCL2和CXCL1的表達水平。

在古代偏頭痛就有“經久難愈之頭痛”之稱[23]，屬于中醫學“頭痛”“頭風”范疇。偏頭痛多發于顳側，正如《冷廬醫話》所謂“頭痛屬少陽者，上至兩角，痛在頭角”，其發作部位與少陽經的循行相吻合，與少陽經關系密切。率谷穴為頭部足少陽膽經腧穴，其為足少陽、足太陽交會穴，正如《玉龍歌》云：“偏正頭風痛難醫，絲竹金針亦可施，沿皮向后透率谷，一針兩穴世間稀。”具有調和氣血、活絡止痛之功。陽陵泉為足少陽膽經之合穴，具有活血通絡、疏調經脈的作用。在本課題組的前期臨床研究中，選取了率谷和陽陵泉這2個穴位，發現針灸可降低偏頭痛的頻率和天數，以及疼痛的強度[24]。Liu等[25]對針刺治療慢性偏頭痛動物的報道中，也選取了陽陵泉穴。在本研究中率谷和陽陵泉都為足少陽膽經穴，率谷靠近偏頭痛發作部位，起近治作用，陽陵泉位于遠端，起遠治作用，兩穴合用對慢性偏頭痛大鼠有較好的治療作用。本實驗結果顯示，針刺組與非經非穴組之間的足底機械痛閾具有顯著的差異，可見針刺少陽經穴對于緩解慢性偏頭痛大鼠痛覺過敏具有明顯優勢，可顯著提高大鼠的痛閾。然而，2組在趨化因子表達結果上差異無統計學意義，但從數據結果可見，針刺組對CCL2和CXCL1的下調作用優于非經非穴組，后續的實驗可以擴大樣本量，使得此趨向更加明顯。

趨化因子是一類結構相似的小分子分泌蛋白，參與了細胞遷移、增殖、炎癥等生理和病理過程[26]。已有臨床研究表明，偏頭痛患者血清中CCL2表達升高[27]。在動物研究中也發現，星形膠質細胞上CCL2的過表達會引起大鼠的熱痛覺過敏[28]。CXCL1屬于CXC趨化因子家族，CXCL1可以參與中性粒細胞的趨化和脫顆粒，并介導炎癥性疼痛，爪底直接注射CXCL1可誘發機械性痛覺過敏[29]。也有研究表明CXCL1含量在偏頭痛患者血清中升高[13]。近年來針刺通過趨化因子參與疼痛調節的研究受到了廣泛的關注，研究表明，針刺可通過調節趨化因子表達和募集免疫細胞釋放阿片肽類物質產生鎮痛作用[30]。有研究表明，針灸可以抑制CCL2的表達，抑制星形膠質細胞c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)的激活而減輕神經病理性疼痛[31]。在佐劑性關節炎大鼠模型中，針刺可以調控脊髓部位CXCL1發揮鎮痛作用[32]。在本研究中，NTG組大鼠的趨化因子水平明顯升高，與以上研究中的結果一致；針刺降低了Sp5C中趨化因子CCL2和CXCL1的表達水平，表明了針刺少陽經穴可以通過抑制趨化因子從而發揮對慢性偏頭痛大鼠的鎮痛作用。

本實驗研究了針刺對慢性偏頭痛大鼠趨化因子的影響，為針刺治療偏頭痛的分子機制提供了新線索。近年來研究者們逐漸認識到，脊髓中的膠質細胞可以通過釋放強效的趨化因子，介導神經元和非神經元細胞的相互作用，增強神經炎癥，在神經性病理性疼痛的產生和維持中占據重要地位[33]。最新的研究也指出，趨化因子可能與偏頭痛模型中星形膠質細胞或小膠質細胞的激活相關[14]。目前，膠質細胞在疼痛研究領域受到極高的關注，從“趨化因子-膠質細胞”的角度，在后續實驗中，應深入探求慢性偏頭痛大鼠趨化因子與膠質細胞活化之間的關系，進一步完善針刺在慢性偏頭痛大鼠抗炎鎮痛機制中所發揮的作用。