乳酸桿菌產細菌素對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌臨床株的體外抑菌效果研究

柳青

40 年來,金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌是較常見的呼吸道致病菌,其生物學特征是以生物膜為主的侵襲人體［1］。球菌和鏈球菌大量存活在醫院中,能導致嚴重的院內感染。近些年,肺炎鏈球菌已經是院內感染下呼吸道炎癥最主要的致病菌之一。肺炎鏈球菌會導致長期間斷發作的肺炎,其致病性和病死率均較高。即便大量輸注抗生素,對其也不易形成有效抑制。研究人員發現,細菌導致的肺炎是在生物膜中進行的,是反復感染的原因所在［2］。因外院內獲得性肺炎發病率高,其死亡率可有50%以上。所以,是否能發現一種耐藥性較弱的藥物,就是治療該病的關鍵。之前,由于抗生素的大量使用可以很好地控制細菌繁殖,但是又有大量的過敏癥狀、逐漸增加的耐藥性和肝腎功能損傷,限制了其持續使用。乳酸桿菌產細菌素是明顯抑制細菌繁殖的蛋白質之一,而且細菌素對細菌載體無明顯損傷,具有優良的生物穩定性,可以在腸道內直接吸收,不會產生蓄積作用,現在已經被越來越多的臨床醫師所注意。細菌素作為一種抗菌化合物,具有強烈抗菌活性,如革蘭陽性和革蘭陰性細菌。此次試驗通過比較乳酸桿菌產細菌素抑制兩種細菌的繁殖和干擾生物膜的功能,體現乳酸桿菌產細菌素對于治療臨床肺炎的重要意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019 年1 月～2020 年12 月北部戰區總醫院中收治的40 例肺炎患者作為研究對象,痰液中分離培養出20 株金黃色葡萄球菌和20 株肺炎鏈球菌。

1.2試劑與儀器 選用保溫的培養箱、菌落分析儀(法國BioMerieux 公司),VITEK-32 全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司),旋轉振蕩器(上海皓莊儀器有限公司),-80℃低溫培養箱(美國Thermo 公司),高壓滅菌儀(寧波Runyes 公司),電子掃描顯微鏡(日本Nikon 公司),潔凈操作臺(美國Thermo 公司)。

1.3方法

1.3.1痰液標本采集 囑患者早晨先用干凈水清潔口腔,再使勁咳嗽,將氣道深處的痰液咳出,留取第二次的痰液,放在無菌試管內保存,立即送檢。把送來的痰液播撒在血瓊脂表面,在低濃度氧氣環境下(5%O2,10%CO2,85%N2)37 ℃培養24 h。再把細菌放置在VITEK-32 全自動微生物分析儀內經液化后放置在-80℃保存。試驗時把兩種致病菌放置在血瓊脂上(37℃,6%CO2培養箱)培養24 h。

1.3.2乳酸桿菌產細菌素提取 把乳酸桿菌放置在血瓊脂上培養24 h(37℃,6%CO2培養箱),乳酸桿菌從發酵物中提取。用分析儀調配濃度為3×108CFU/ml 的乳酸桿菌懸濁液。5 ml 乳酸桿菌懸濁液和95 ml 液體培養基(大豆蛋白粉、牛肉粉、發酵粉提供氮元素和其他營養物質；葡萄糖是可水解的糖類；磷酸氫二鉀作為酸堿中和劑；檸檬酸三銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 和乙酸鈉為可以產生各種生長因子,并干擾其他雜菌的生長；瓊脂可固定懸濁液)攪拌后放置在37℃、6%CO2培養箱中,培養48 h,用離心機分離出混懸液的上清液,用0.22 μm 的生物膜把細菌過濾后提取其蛋白。再次放在離心機中壓縮至1 ml,然后放在EP 管中,用4℃的清液進行封存。

1.3.3乳酸桿菌產細菌素對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌分離株的生長抑制作用 把金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌都稀釋為1.5×108CFU/ml 的混懸液后,實驗組分別添加0.05 ml 金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的混懸液、0.1 ml 細菌素混懸液和2 ml BHI 液體培養基(用動物內臟浸入肉湯中生成的培養物通常簡稱BHI 培養基,主要保存各種難以生存的致病微生物,BHI 培養基是廣泛使用的培養基,細菌、霉菌和發酵菌都可以繁殖)。操作過程中必須保持實驗的公平性和合理性,所有操作都用移液槍轉移混懸液。對照組的細菌素混懸液替換為生理鹽水,所有標本都放置在37℃、6%CO2培養箱中培養24 h。

24 h 培養結束后取出試管充分震蕩,提取0.1 ml的混懸液,將其濃度逐漸稀釋至10-6倍,再取其中的0.05 ml 稀釋后的混懸液平均播撒在血瓊脂上,用37℃、6%CO2培養箱培養24 h,最后計算菌落總數(CFU)。根據公式：抑菌率(%)=(對照組細菌菌落總數-實驗組細菌菌落總數)/對照組細菌菌落總數×100%,推算出抑菌率。

1.3.4乳酸桿菌產細菌素對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌分離株生物膜的作用 ①生成金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的生物膜：把金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌分別放置在血瓊脂培養皿中,在37℃、6%CO2的培養箱中培養24 h,放置在酸堿中和液中,混合成1.5×108CFU/ml 的懸濁液,把蓋玻片放置在無菌平皿中,實驗組中放入9 ml BHI 液體培養基和含有0.1 ml 金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌的混懸液,0.1 ml 的細菌素混懸液；對照組中放入9 ml BHI 液體培養基和0.1 ml 酸堿中和液,0.1 ml 金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌的混懸液,全部放置在37℃、6%CO2的培養箱中保存24 h。②計算體外生物膜細菌個數：生物膜生成24 h 后移走蓋玻片,進行充分剝離出粘附在表面的細菌后用酸堿中和液逐漸稀釋到10-4倍,取出約0.05 ml 的混懸液平均播撒在血瓊脂上,在37℃、6%CO2培養箱中培養24 h,計算菌落總數。根據公式：滅活率(%)=(對照組細菌菌落總數-實驗組細菌菌落總數)/對照組細菌菌落總數×100%,推算出滅活率。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1兩組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數比較實驗組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數分別為(3.41±0.91)×108CFU/ml、(4.81±1.21)×108CFU/ml,均低于對照組的(12.76±3.21)×108CFU/ml、(14.32±3.81)×108CFU/ml,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數比較(,×108 CFU/ml)

表1 兩組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數比較(,×108 CFU/ml)

注：與對照組比較,aP＜0.05

2.2乳酸桿菌產細菌素對不同細菌的抑菌率、滅活率比較 乳酸桿菌產細菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌率為89.64%、滅活率為73.28%,均高于對肺炎鏈球菌的75.11%、66.41%。見表2。

表2 乳酸桿菌產細菌素對不同細菌的抑菌率、滅活率比較(%)

3 討論

金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌是人類呼吸道的主要致病菌［3］。生物膜是許多微生物的基本結構,以此為特點的致病菌可導致許多感染疾病［4］。根據研究認為抗菌藥物出現耐藥性是生物膜的特殊功能導致的,因此,發現可靠消除生物膜的方法就成為臨床探討的重點。試驗證實［5］,細菌素能抑制生物膜的形成,降低細菌的耐藥性。此次試驗中,乳酸桿菌中提取的細菌素對臨床分離致病菌有很強的抑制作用,與金瑛等［6］和楊玉芳等［7］的試驗結果相同。細菌素是一種兼具抗革蘭陽性和陰性菌的化合物。所以細菌素可以對許多致病菌產生抗菌作用。金亮等［8］從生乳中分離,該菌株產生細菌,對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有活性,產生的抗菌物質對蛋白質溶解敏感,具有耐熱性,對多種pH 有抗性。姜晶［9］在4℃和15℃的兩種不同儲存溫度下,在乳酪繁殖的情況下檢測透明乳桿菌2a的含量,并且在兩種溫度下抑制單個細胞基因的生長。張國強等［10］比較了在萊桑乳清中培養的30 株乳酸桿菌的抗真菌特性,發現了一種可以抗真菌的乳酸桿菌。匡珍等［11］從母乳喂養的嬰兒糞便中提取出22 株乳酸菌BL-1,可明顯抑制革蘭陰性菌的生長。胡付品等［12］從酸菜中提取出4 株乳酸菌SD-22,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較強抗菌功能。乳酸桿菌通常被認為是安全的微生物,大部分細菌都是天然的,并且乳酸桿菌具有良好的熱穩定性和對酸、鹽和酶的耐受性。乳酸桿菌具有高效率、廣泛和安全性的特點,可有效影響致病菌的生長。所以,探究乳酸桿菌所分泌的細菌素對致病菌的生長抑制作用,就顯得尤為重要。

綜上所述,乳酸桿菌產細菌素對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌的生長及生物膜都表現出較強的抑制作用,相比之下,對金黃色葡萄球菌的抑制作用更明顯,可以體現乳酸桿菌產細菌素在臨床上顯著減輕肺炎癥狀的重要價值。