有氧運動對糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達的影響

張明耀

前言

糖尿病是一種由于遺傳或后天因素共同體作用下，導致機體胰島素分泌不足或胰島素抵抗，而發生糖、脂肪、蛋白質等代謝紊亂的慢性綜合征。根據2021年國際糖尿病聯合會(IDF)發布的最新糖尿病調查數據顯示，全球20至79歲的成年人中，糖尿病患者數量約為5.37億人(患病率10.5%)。按目前的發展速度推算，到2030年全球成年人糖尿病患者人數將增至6.43億，2045年將上升到7.83億。目前，我國糖尿病患者數量仍居于世界首位，約為1.41億人，預計到2030年將達到1.64億人。糖尿病已成為21世紀主要公共衛生問題，給個人、家庭及社會帶來沉重的經濟、生活負擔。目前，防治糖尿病的方法主要包括藥物治療、飲食療法、運動干預、糖尿病教育和自我血糖監測等五個方面。在臨床上糖尿病治療仍是以藥物為主，然而藥物治療容易帶來一些副作用。近年來，運動已成為糖尿病預防和治療的有效手段，但有關運動防治糖尿病的具體機制尚未完全明確，還有待進一步探索。因此，本研究通過高脂飼料喂養，注射小劑量鏈脲佐菌素建立糖尿病模型大鼠，并對糖尿病大鼠進行8周游泳運動干預，觀察游泳運動對糖尿病大鼠血糖、血脂代謝和骨骼肌AMPK、GLUT4蛋白表達的影響，旨在為運動防治糖尿病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選用6周齡的SPF級雄性SD大鼠40只，體重130±20g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號：SCKX(粵)2013-0002。適應性喂養1周后，大鼠隨機分為正常對照組(NC，n=10)和模型組(n=30)，NC組大鼠普通飼料喂養，模型組大鼠采用高脂飼料喂養8周后，禁食12h，行腹腔注射小劑量的鏈尿佐菌素(STZ，30mg/kg)，最終形成糖尿病模型大鼠有25只(成模率83%)。再將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病安靜組(DM，n=12)和糖尿病運動組(DME，n=13)。所有大鼠分籠飼養，自由飲水攝食，每日添加足夠的飼料，定期更換墊料，室內溫度為24±2℃，相對濕度40%～60%，自然光照。

1.2 運動方案

糖尿病運動組(DME)大鼠進行無負重游泳運動干預8周，先進行適應性游泳運動1周，前兩天每天運動20min，之后每天逐步增加10～20min。從第二周開始每天運動60min，1次/天，6次/周。運動時間統一為每天晚上18:00～21:00，水溫30±2℃，水深﹥65cm，保證平均每只老鼠擁有足夠的活動面積(≥200cm2)。

1.3 取材與指標檢測

最后一次游泳運動結束后，所有大鼠禁食，空腹12h，行腹腔注射水合氯醛(0.3ml/100g)，待大鼠麻醉后置于冰塊上，迅速采集血液、股四頭肌等組織。腹主動脈取血于抗凝管內靜置1h后，4℃、3000轉/min，離心10min，取血清分裝于EP管，-20℃冰箱保存待測血液指標(FBG、FINS、血脂四項等)。大鼠股四頭肌用4℃生理鹽水清洗血漬，吸干，分成數段后錫箔紙包裹放液氮灌中速凍，之后轉存至-80℃超低溫冰箱，用于檢測骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達。空腹胰島素(FINS)和血脂四項(TG、TC、LDL-C、HDL-C)的檢測采用聯酶免疫吸附測定法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑盒說明書進行；AMPK和GLUT4蛋白表達采用Western Blot法。以上各實驗步驟嚴格按照實驗標準要求進行。

1.4 數理統計

運用SPSS21.0統計軟件對本研究中所得的實驗數據進行統計學處理，數據以均值±標準差(M±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著性水平。

2 結果

2.1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI 的變化

如表1所示，與NC組相比，DM組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，而ISI顯著降低(P<0.05)。與DM組相比，DME組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著降低(P<0.05)，ISI顯著升高(P<0.01)。

表1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和ISI的變化(M±SD,單位：mmol/L)

2.2 各組大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C的變化

如表2所示，與NC組比，DM組大鼠TC、TG和LDL-C含量均顯著增加(P<0.01)，而HDL-C含量顯著減少(P<0.01)；與DM組相比，DME組大鼠TC、TG、LDL-C含量均顯著降低(P<0.01)，而HDL-C含量顯著增加(P<0.05)。

表2 各組大鼠TG、TC、HDL-C和LDL-C的變化(M±SD單位：mmol/L)

2.3 各組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達量的變化

如表3所示，與NC組比，DM組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)；與DM組相比，DME組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)。

表3 各組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達量的變化(M±SD)

3 討論

3.1 有氧運動對糖尿病大鼠血糖及胰島素抵抗的影響

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，其發病機制比較復雜，目前認為，胰島素分泌不足和/或胰島素抵抗均有可能引起糖尿病。糖尿病患者以高血糖為主要特點，典型的臨床癥狀是“三多一少”癥，即多飲、多尿、多食和體重減少。正常生理情況下，機體糖代謝的調節是由胰島素和胰高血糖素共同完成。進食后，胰島素分泌增多，有利于細胞組織對葡萄糖的攝取利用，促進糖合成，減少糖異生；饑餓時，胰高血糖素分泌增多，糖分解和糖異生加強。胰島素和胰高血糖素的協調控制維持著機體糖代謝的平衡。研究表明，長期高脂飲食結合鏈脲佐菌素能使大鼠形成糖尿病[1]。本研究結果顯示(見表1)，與NC組相比，DM和DME組，FBG、FINS和HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，ISI顯著降低(P<0.05),提示8周高脂飲食和注射小劑量鏈脲佐菌素使大鼠血糖明顯升高，并且出現胰島素抵抗狀態，說明成功誘導出糖尿病大鼠模型，符合糖尿病動物模型制備要求，為后續運動干預提供了基礎。

運動作為多種慢性疾病干預手段，發揮著越來越重要的作用。研究表明，不管是有氧運動還是抗阻運動，都能有效改善血糖調節和胰島素抵抗[2、3]。合理的運動鍛煉可以減輕體重，降低人和大鼠FBG、FINS，增加胰島素敏感性和糖耐量，改善胰島素抵抗癥狀[4]。Motahari等[5]發現運動不僅可以降低糖尿病患者血糖、胰島素水平和胰島素抵抗，還能增強胰島素敏感性，減輕高胰島素血癥。Snowling和Hopkins對糖尿病患者進行有氧、抗阻和聯合訓練干預研究發現，三種運動模式都可以改善患者HbA1c、空腹和餐后血糖水平、胰島素敏感性和空腹胰島素水平，并且不同運動模式之間干預效果差異較小[6]。Jelleyman等[7]研究表明，高強度間歇訓練可以增加骨骼肌氧化能力、血糖控制和胰島素敏感性。本研究結果顯示(見表1)，與DM組相比，DME組，FBG、FINS和HOMA-IR均顯著降低(P<0.05)，ISI顯著升高(P<0.05)；說明游泳運動能使糖尿病大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR顯著下降，ISI顯著升高，大鼠高血糖、高胰島素和胰島素抵抗狀態得到緩解，游泳運動能夠改善糖尿病大鼠血糖代謝狀況及胰島素敏感性。運動可以增加骨骼肌線粒體含量和氧化酶，通過胰島素依賴和胰島素非依賴機制增強骨骼肌葡萄糖攝取，改善血糖調節，增加的胰島素敏感性[8、9]。

3.2 有氧運動對糖尿病大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C的影響

脂代謝在糖尿病的發生、發展過程中扮演著重要的角色，脂代謝紊亂會引起超重、肥胖、胰島素抵抗等，導致糖尿病及其并發癥的發生。研究表明，有氧運動有利于維持脂代謝平衡，改善糖尿病及其并發癥[10]。血漿中FFA、TG、LDL含量增加，是導致IR的重要原因之一[11]，FFA和TG升高會抑制胰島素介導的葡萄糖的攝取、氧化和利用。本研究結果顯示(見表2)，糖尿病大鼠血清TG、TC和LDL-C含量均明顯高于NC組(P<0.05)，而HDL-C含量明顯低于NC組(P<0.01)。提示長期的高脂飲食攝入過多的能量，使體內FFA和TG、TC、LDL-C含量升高，導致大鼠脂代謝異常。以往研究表明，運動可以改善機體的糖脂代謝，降低血清TG、TC、LDL含量，提高HDL，減輕肥胖造成高血脂現象[12]。8周以上的游泳運動不但具有減肥、降低血脂、改善胰島素敏感性的作用，而且還可以使2型糖尿病大鼠機體的高血糖水平明顯減低[13]。本研究結果顯示(見表2)，與DM組比較，DME組大鼠HDL-C顯著升高(P<0.05)，FFA、TG、TC和LDL-C水平均顯著均降低(P<0.01)，提示運動能降低大鼠血清TG、TC和LDL-C水平，增加HDL-C含量。結合本研究糖尿病大鼠FBG、FINS和ISI，發現運動能增加大鼠胰島素敏感性，降低空腹胰島素和胰島素抵抗指數，運動改善高脂飲食大鼠糖尿病癥狀的機制可能與糾正脂代謝紊亂有關。運動使骨骼肌對脂肪酸氧化能力增強，減少脂質異位沉積，改變血清脂蛋白的成分比例，降低血脂FFA和TG濃度，進而改善脂代謝紊亂。

3.3 有氧運動對糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達水平的影響

AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)在調節生物能量代謝中起到關鍵作用，是主要的非胰島素依賴型葡萄糖攝取調節劑，通過運動激活骨骼肌中的AMPK可誘導葡萄糖轉運、脂質和蛋白質合成以及營養代謝[14]。AMPK在運動后保持短暫激活，并調節涉及線粒體生物功能以及氧化能力的幾個下游靶標，有氧運動增加骨骼肌線粒體含量和氧化酶，從而改善葡萄糖和脂肪酸氧化，并增加參與胰島素信號傳導的AMPK蛋白表達[15、16]。Stephens等[17]研究發現，在培養骨骼肌細胞時，應用AMPK作為特異性激活劑，能夠增加胰島素刺激后葡萄糖轉運的能力。另外，骨骼肌對葡萄糖的利用效率影響到機體血糖調節，胰島素介導下葡萄糖的攝取與轉運機制比較復雜，GLUT4(葡萄糖轉運蛋白4)對維持骨骼肌細胞葡萄糖穩態起到重要作用[18、19]。研究顯示，降低脂肪組織GLUT4表達，胰島素刺激的骨骼肌對脂肪攝取能力會下降，胰島素抵抗與肥胖大鼠骨骼肌GLUT4下降有關[20、21]。運動可以誘導骨骼肌細胞內GLUT4易位，促進骨骼肌對葡萄糖的攝取，耐力訓練、高強度間歇訓練和力量訓練均可引起糖尿病患者骨骼肌GLUT4蛋白含量增加[22-24]。本研究結果顯示(見表3)，與DM組相比，DME組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達均顯著升高(P<0.01)，提示DME組大鼠血糖、胰島素敏感性及血脂(TG、TC、LDL-C)改善可能與AMPK和GLUT4蛋白表達增加有關。有氧運動能夠激活AMPK、增加骨骼肌細胞GLUT4轉位，通過AMPK信號通路或PI3K/AKT/GLUT4信號轉導通路，促進葡萄糖的攝取、利用和脂肪酸的氧化，減少糖原合成與脂質的堆積，特別是骨骼肌和肝臟脂肪的異位堆積，AMPK還可能通過非胰島素依賴途徑調節糖脂代謝，改善大鼠胰島素抵抗[25-27]。

4 結論

8周游泳運動能夠較好地控制糖尿病大鼠血糖、血脂水平，提高大鼠胰島素敏感性；游泳運動能夠增加大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4的蛋白表達，改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗。