磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成類U在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義的生物信息學(xué)分析

陳琳，傅芬，陳秋連

1 新余市人民醫(yī)院產(chǎn)科，江西 新余 338000

2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南昌 330006

卵巢癌是病死率較高的婦科惡性腫瘤之一[1]。2018年，全球新增約300 000例卵巢癌確診病例，病死約185 000例[2]。卵巢癌早期癥狀不典型，不利于早期篩查，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期，預(yù)后較差[3-4]。手術(shù)切除和鉑類藥物化療是晚期卵巢癌的一線治療方案[5-6]，但研究顯示，卵巢癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物表現(xiàn)出了耐藥性，一般來講，鉑耐藥預(yù)示著極差的預(yù)后。如卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出耐藥性，卵巢癌患者的總生存率僅為12~24個(gè)月，因此，尋找合適的診斷方案對(duì)提高患者的總生存率有重要意義[7-8]。

美國(guó)食品藥品管理局（FDA）提出，糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）可以作為卵巢癌一線治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)[9]，但靈敏度和準(zhǔn)確度不高。尋找特異性的生物標(biāo)志物對(duì)預(yù)測(cè)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后至關(guān)重要。磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成類U（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class U，PIGU）是糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)氨酶（glycosylphosphatidylinositol transamidase，GPI-T）復(fù)合物的重要亞單位[10]。GPI-T復(fù)合物介導(dǎo)糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨與錨定蛋白結(jié)合，主要由5個(gè)亞基組成[11-12]。既往研究表明，GPI-T復(fù)合物在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究顯示，GPI-T復(fù)合物某些成分的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤和非小細(xì)胞肺癌[10]。PIGU過表達(dá)預(yù)示著肝癌患者的不良預(yù)后，但其與卵巢癌的關(guān)系未見報(bào)道[13]。前期生物信息學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)，PIGU在高級(jí)別卵巢癌中異常高表達(dá)，且其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

本研究通過生物信息學(xué)分析GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值。通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因 型-組 織 表 達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫比較GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)情況，利用Kaplan-Meier Plotter（KMPLot）、基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫分析PIGU對(duì)卵巢癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究對(duì)PIGU蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能分析，闡釋PIGU在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中潛在的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 TCGA、GTEx數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

TCGA是由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）和美國(guó)國(guó)家人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）于2006年聯(lián)合啟動(dòng)的項(xiàng)目，收錄了各種人類腫瘤（包括亞型在內(nèi)）的臨床數(shù)據(jù)、基因組變異、信使RNA（messenger RNA，mRNA）表達(dá)情況、微小RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)情況、甲基化等數(shù)據(jù)，是腫瘤研究重要的數(shù)據(jù)來源。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載279例卵巢癌患者的全基因組表達(dá)量矩陣，包括卵巢癌mRNA表達(dá)、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和生存情況的數(shù)據(jù)。

GTEx是一個(gè)全面的公共資源，研究組織特異性基因表達(dá)和調(diào)控，數(shù)據(jù)庫中的樣本收集自54個(gè)非病變組織，涵蓋近1000例個(gè)體。GTEx數(shù)據(jù)庫主要用于分子分析，包括全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）、全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（whole transcriptome sequencing，RNA-Seq）。正常對(duì)照從GTEx生物庫獲取。本研究從GTEx數(shù)據(jù)庫（https://xenabrowser.net/hub/）下載88例卵巢癌正常組織的全基因組表達(dá)量矩陣，對(duì)GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因進(jìn)行差異分析。

1.2 生存分析

KMPLot數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com）是一種基于網(wǎng)絡(luò)的工具，能夠?qū)蚪M學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)或代謝組學(xué)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)生存分析[14]。本研究通過KMPLot數(shù)據(jù)庫，根據(jù)表達(dá)量的中位數(shù)將卵巢癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行生存分析和生存曲線的繪制。

1.3 GEO數(shù)據(jù)庫分析

GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是高通量微陣列和下一代序列功能基因組數(shù)據(jù)集的國(guó)際公共存儲(chǔ)庫[15]。為進(jìn)一步驗(yàn)證PIGU基因在卵巢癌中的重要性，本研究自GEO數(shù)據(jù)庫中下載了GSE18520（對(duì) 照10例∶卵 巢 癌53例）和GSE26712（對(duì)照10例∶卵巢癌185例）數(shù)據(jù)集，進(jìn)行基因差異分析。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

GeneMANIA數(shù)據(jù)庫（http://genemania.org/）是一個(gè)交互式、可視化的在線蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)工具[16-17]。GeneMANIA利用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)給定的基因查詢列表進(jìn)行分析，通過識(shí)別出功能相似的基因，來獲得目標(biāo)基因的相互作用蛋白。本研究設(shè)置基因列表為PIGU，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，以獲得相互作用蛋白。

1.5 功能富集分析

WebGestalt數(shù)據(jù)庫（http://www.webgestalt.org/）是一個(gè)網(wǎng)頁工具平臺(tái)，用于分析來自大規(guī)模組學(xué)研究的基因列表。在2019年的更新中，WebGestalt數(shù)據(jù)庫支持12個(gè)生物體、342個(gè)基因標(biāo)識(shí)符、155 175個(gè)功能類別及用戶上傳的功能數(shù)據(jù)庫[18]。本研究利用WebGestalt工具進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes，KEGG）分析，以揭示PIGU及其關(guān)鍵互作分子參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的潛在分子機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌與正常卵巢組織中表達(dá)情況

下載TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌患者卵巢癌組織及GTEx數(shù)據(jù)庫中卵巢正常組織的全基因組的表達(dá)量矩陣，分析GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因，包括磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成類K（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class K，PIGK）、PIGU、磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成類T（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class T，PIGT）、糖基磷脂酰肌醇錨定附著蛋白1（glycosylphosphatidylinositol anchor attachment 1，GPAA1）、磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成類S（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class S，PIGS）的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，與卵巢正常組織相比，卵巢癌組織中PIGS表達(dá)明顯下調(diào)，PIGK、PIGU、PIGT、GPAA1的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌組織及卵巢正常組織中的表達(dá)差異熱圖

表1 TCGA與GTEx數(shù)據(jù)庫中GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌組織及卵巢正常組織中相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2 GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因與預(yù)后的關(guān)系

通 過KMPLot數(shù) 據(jù) 庫，根 據(jù)PIGU、PIGT、GPAA1、PIGK、PIGS相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析總生存期（overall survival，OS）和無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS），結(jié)果顯示，PIGU表達(dá)與卵巢癌患者的OS、PFS均有關(guān)（P＜0.05），PIGU高表達(dá)卵巢癌患者的OS、PFS均低于PIGU低表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2、圖2、圖3）

圖2 PIGU高表達(dá)組（n=326）和PIGU低表達(dá)組（n=329）卵巢癌患者的OS曲線

圖3 PIGU高表達(dá)組（n=306）和PIGU低表達(dá)組（n=308）卵巢癌患者的PFS曲線

表2 GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因與卵巢癌患者OS、PFS的關(guān)系

2.3 GEO數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證PIGU的重要性

GSE18520（對(duì) 照10例∶卵 巢 癌53例）和GSE26712（對(duì)照10例∶卵巢癌185例）數(shù)據(jù)集GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因的差異表達(dá)結(jié)果顯示，PIGU基因在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于卵巢正常組織（P＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)了PIGU在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。（表3、表4）

表3 GSE18520數(shù)據(jù)庫中GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌組織及卵巢正常組織中相對(duì)表達(dá)量的比較

表4 GSE26712數(shù)據(jù)庫中GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌組織及卵巢正常組織中相對(duì)表達(dá)量的比較

2.4 PIGU蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過GeneMANIA網(wǎng)站預(yù)測(cè)PIGU的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了包括PIGS、PIGK、PIGT、GPAA1等在內(nèi)的20個(gè)關(guān)鍵互作分子。（圖4）

圖4 PIGU蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 KEGG通路分析結(jié)果

將PIGU及預(yù)測(cè)的關(guān)鍵互作基因在WebGestalt網(wǎng)頁工具平臺(tái)進(jìn)行KEGG通路分析，揭示了PIGU及其關(guān)鍵互作分子的潛在分子機(jī)制，證實(shí)PIGU通過調(diào)控糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、代謝通路和N-聚糖生物合成通路，影響了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。（圖5）

圖5 PIGU基因及關(guān)鍵互作分子的KEGG通路分析

3 討論

卵巢癌是病死率較高的婦科惡性腫瘤，盡管近年來手術(shù)和化療在卵巢癌的治療中取得了重大突破，但卵巢癌患者的生存率并沒有明顯提高。卵巢癌高病死率可以部分歸因于早期診斷困難，60%的患者確診時(shí)已進(jìn)入晚期，5年總生存率僅為29%[3]。卵巢癌的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類/紫杉醇化療，盡管此治療方案對(duì)80%~90%的患者有效，但多數(shù)患者還是會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和對(duì)化療藥物耐藥[19]。腫瘤的異質(zhì)性或許可以部分解釋治療的局限性，患者的臨床特征與其分子特征密切相關(guān)，如在上皮性卵巢癌中會(huì)出現(xiàn)鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）或erb-b2受體酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）基因體突變。同時(shí)，缺乏TP53突變的病灶進(jìn)展過程是逐步的，利于早期診斷[20]。還有研究指出，高漿液性卵巢癌患者中，50%以上存在同源重組缺陷。由于基因甲基化和突變，DNA同源修復(fù)的相關(guān)基因會(huì)發(fā)生突變，如乳腺癌易感基 因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）、RAD51C等純和缺失，最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加[21]。由此可以看出，卵巢癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤。異質(zhì)性也是導(dǎo)致個(gè)體療效差異、后期復(fù)發(fā)的重要因素，同時(shí)也是部分靶向藥物治療失敗的關(guān)鍵原因[22]。因此，對(duì)卵巢癌基因及相關(guān)分子通路的研究可以更好地指導(dǎo)比標(biāo)準(zhǔn)化化療更具有特異性的新型靶向藥物的開發(fā)。目前，復(fù)發(fā)卵巢癌治療方案的選擇標(biāo)準(zhǔn)，如婦科腫瘤學(xué)評(píng)分（Arbeitsgemeinschaft Gynaekologische Onkologie，AGO）、美國(guó)斯隆-凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC）提出的MSK均處于臨床研究階段，且評(píng)分陽性并不能完全反映患者情況，還需要多個(gè)因素的綜合評(píng)估[23]。提示迫切需要尋找新的腫瘤標(biāo)志物來預(yù)測(cè)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，更利于有針對(duì)性的臨床篩查和治療方案的選擇。

本研究利用多個(gè)生物信息學(xué)平臺(tái)對(duì)卵巢癌的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因中，PIGU、PIGT、GPAA1、PIGK在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)，且PIGU高表達(dá)與卵巢癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，表明PIGU是一個(gè)潛在的致癌基因。此外，基于2個(gè)GEO數(shù)據(jù)集的表達(dá)差異分析也進(jìn)一步驗(yàn)證了PIGU在卵巢癌中的重要性。有研究指出，PIGU在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，可能通過激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路和促進(jìn)免疫逃逸來促進(jìn)干細(xì)胞肝癌的進(jìn)展[13]；功能分析表明，PIGU可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的存活、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡[24]。但目前缺少PIGU與卵巢癌的研究報(bào)道，因此，關(guān)于PIGU在卵巢癌中的作用及分子機(jī)制還缺少在基礎(chǔ)研究層面的進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過GeneMANIA預(yù)測(cè)PIGU的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了包括PIGS、PIGK、PIGT、GPAA1在內(nèi)的20個(gè)關(guān)鍵互作分子。隨后，本研究對(duì)PIGU及預(yù)測(cè)的關(guān)鍵互作基因進(jìn)行KEGG通路分析，揭示了PIGU及其關(guān)鍵互作分子的潛在分子機(jī)制。表明PIGU參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，初步展現(xiàn)了PIGU及其互作基因的相關(guān)作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究系統(tǒng)地分析和評(píng)估了GPI-T復(fù)合物相關(guān)基因在卵巢癌組織中的表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，PIGU高表達(dá)提示卵巢癌患者的預(yù)后較差。由此推斷PIGU的相對(duì)表達(dá)量可以作為卵巢癌診斷和預(yù)后評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究的不足之處在于只是在轉(zhuǎn)錄組層面驗(yàn)證了PIGU高表達(dá)與卵巢癌的相關(guān)性，由于蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量在一定程度上不與相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組水平呈正比，可能無法全面反映PIGU蛋白質(zhì)的含量及相關(guān)功能。此外，本研究結(jié)果還需要通過進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)分析，來證實(shí)PIGU在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。