脂聯素通過調節BMP信號通路促進骨髓干細胞成骨分化

劉雷 毛文 鄭一舟 祁福 李紅 張明煥

武漢市第三醫院，湖北 武漢 430074

骨組織具有極大的修復和再生能力，由創傷、手術切除、感染和先天性骨病等造成的大塊骨缺損的修復和功能重建一直是骨科領域的難題和研究熱點[1-2]。針對大塊骨缺損的治療，自體骨移植一直被認為是其修復方法，但該方法存在供骨來源有限且操作復雜等缺點[3]。隨著組織工程學的發展，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在大塊骨缺損的骨骼修復中具有重要作用[4]。BMSCs是一種多潛能的干細胞，具有干細胞特性，可分化為軟骨細胞、肌細胞、成骨細胞和脂肪細胞等[5]。BMSCs所參與的成骨過程是骨形成的關鍵步驟，從骨祖細胞到成骨前細胞，最終分化為成熟的成骨細胞[6]。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通路是體外調控成骨分化和體內骨形成的重要途徑之一[7-8]。脂聯素(adiponectin, ApN)是脂肪組織分泌的一種脂肪因子，研究[9-11]表明，ApN可通過多種途徑促進骨形成。本實驗旨在研究ApN對BMSCs成骨分化的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人BMSCs和hMSC無血清培養液購自中國科學院上海細胞庫；L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松購自Sigma公司；NheI、KpnI、AgeI和EcoRI購自NEB公司；T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自天根公司；TOP10感受態細胞購自索萊寶公司；Opti-MEM購自Gibgo公司；Lipofectamine 2000購自凱瑞基公司；茜素紅法鈣質染色試劑盒購自上海歌凡公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色液購自Servicebio公司；Trizol購自Ambion公司；SYBR FAST qPCR Master Mix購自KAPA Biosystems公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio公司；PVDF轉移膜和化學發光試劑購自Millipore公司；兔抗ApN抗體購自Bioswamp公司。

1.2 細胞培養

將BMSCs接種于hMSC無血清培養液，置于37 ℃、5 % CO2的環境培養。待細胞長至80 %～90 %融合時，將無血清培養液更換為成骨誘導分化所用的完全培養基(L-抗壞血酸50 μg/mL、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、地塞米松10-8mol/L)，誘導培養14 d。

1.3 過表達及干擾質粒構建

設計并合成ApN基因過表達引物(3對shRNA)，PCR擴增。PCR產物通過瓊脂糖電泳后切膠回收，和載體PCDNA3.1-EGFP(pLKO.1-EGFP)分別用NheI和KpnI(AgeI和EcoRI)雙酶切，回收酶切產物，加入T4連接酶及連接反應緩沖液，16 ℃連接過夜，連接產物經TOP10感受態細胞轉化，挑選陽性克隆菌落接種于含抗生素的LB培養基，37 ℃培養12 h，PCR驗證菌落，陽性克隆測序。

1.4 細胞轉染

轉染前24 h，在6孔板接種5×105個細胞，當細胞融合度為90 %進行轉染。用250 μL Opti-MEM稀釋4 μg質粒DNA。用250 μL Opti-MEM稀釋10 μL Lipofectamine 2000，室溫靜置5 min。混勻兩種稀釋液，室溫靜置20 min。將500 μL復合物加到含有細胞和換有1.5 mL新鮮培養基的培養板中，輕搖培養板。將培養板置于37 ℃、5 % CO2培養箱，培養48 h。

1.5 細胞分組與處理

將BMSCs分為5組：對照組、過表達組、過表達空載組、干擾組和干擾空載組。對照組不做任何處理。過表達組BMSCs轉染ApN過表達質粒。過表達空載組BMSCs轉染過表達空載質粒。干擾組BMSCs轉染ApN干擾質粒。干擾空載組BMSCs轉染干擾空載質粒。轉染48 h。

1.6 茜素紅染色

PBS清洗細胞，4 %多聚甲醛固定30 min。吸去4 %多聚甲醛溶液，加入2 mL茜素紅染色液染色30 min，蒸餾水清洗，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 ALP染色

取6孔板培養各組細胞，PBS清洗。加入2 mL 4 %多聚甲醛固定15 min，PBS清洗。加入2 mL ALP染色液，避光染色15 min，PBS清洗，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 qRT-PCR檢測

取各組細胞約1×106個，加1 mL Trizol提取總RNA。反轉錄合成cDNA，10 μL SYBR FAST qPCR Master Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL cDNA模板，8 μL ddH2O。反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，進行40個循環。GAPDH作為內參，使用2-ΔΔCT法進行統計分析。

1.9 Western Blot檢測

收集各組細胞約1×106個，加200 μL裂解液，4 ℃，12 000g離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉移至PVDF膜上。4 ℃環境中，5 %脫脂奶粉封閉12 h，分別加入兔抗ApN(稀釋比1∶1 000)兔抗GAPDH(稀釋比1∶1 000)，室溫孵育1 h。蒸餾水清洗膜，加入HRP標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。蒸餾水清洗膜后加入ECL化學發光試劑，在暗的環境中曝光顯影，讀取蛋白條帶灰度值，統計分析灰度值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

注：A：qRT-PCR檢測ApN mRNA表達量；B：Western Blot檢測ApN蛋白表達量；與對照組比較，*P<0.05。圖1 轉染效率鑒定Fig.1 Identification of transfection efficiency

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 轉染效率鑒定

qRT-PCR和Western Blot檢測ApN過表達質粒及干擾質粒轉染效率。結果見圖1，與對照組相比，過表達組BMSCs中ApN mRNA和蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，干擾組BMSCs中ApN mRNA和蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，這一結果表明ApN過表達質粒及干擾質粒轉染成功。本研究選擇干擾效果最好的shRNA-1進行后續實驗。

2.2 ApN促進BMSCs鈣化沉積

茜素紅染色觀察各組細胞鈣化沉積。結果見圖2，與對照組相比，過表達組BMSCs中鈣化沉積增多，干擾組BMSCs中鈣化沉積減少。表明過表達ApN可促進BMSCs鈣化沉積。

圖2 茜素紅染色(100×)Fig.2 Alizarin red staining (100×)

2.3 ApN促進BMSCs成骨分化

ALP染色觀察各組細胞成骨分化能力。結果見圖3，與對照組相比，過表達組BMSCs陽性表達較多，干擾組BMSCs陽性表達較少。表明過表達ApN可促進BMSCs成骨分化。

圖3 ALP染色(100×)Fig.3 ALP staining (100×)

2.4 ApN上調受體AdipoR1和AdipoR2表達

qRT-PCR檢測ApN受體AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達量。結果見圖4，與對照組相比，過表達組BMSCs中AdipoR1和AdipoR2 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，干擾組BMSCs中AdipoR1和AdipoR2 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。表明過表達ApN可上調BMSCs中AdipoR1受體和AdipoR2受體表達。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖4 qRT-PCR檢測AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達量Fig.4 The mRNA expression levels of AdipoR1 and AdipoR2 were detected using qRT-PCR

2.5 ApN上調BMP信號通路及成骨相關基因表達

qRT-PCR檢測BMP信號通路及成骨相關基因mRNA表達量。結果見表2，與對照組相比，過表達組BMSCs中BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，干擾組BMSCs中BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。表明過表達ApN可在基因轉錄水平上上調成骨相關基因表達以激活BMP信號通路。

表2 BMP信號通路及成骨相關基因表達情況

3 討論

脂肪組織被認為是一種簡單的脂質儲存器官，后被發現為重要的內分泌器官，能分泌許多細胞因子，例如ApN、瘦素和抵抗素等[12]。ApN是脂肪組織中含量最豐富的脂肪因子，具有抗炎和增加胰島素敏感性等生物學功能[13]。Yamauchi等[14]最初鑒定了兩種ApN受體，AdipoR1以及AdipoR2，AdipoR1主要在肌肉中表達，AdipoR2主要在肝臟中表達。Berner等[15]在人成骨細胞和鼠成骨細胞系MC3T3-E1中均檢測到ApN及其受體AdipoR1和AdipoR2的表達。Wang等[16]的研究通過免疫組化方法檢測了AdipoR1和AdipoR2在BMSCs中的表達情況，結果顯示AdipoR1在細胞核、細胞質和細胞膜中均有表達，而AdipoR2盡在細胞質和細胞膜中表達，表明ApN與BMSCs存在著密切聯系。Yang等[17]在ApN缺陷型Adipoqtm1Chan小鼠中研究了ApN對骨代謝的影響，結果表明與野生型小鼠相比，ApN缺陷型小鼠骨量減少，破骨細胞和脂肪細胞生成增加，成骨細胞生成減少。這證明了ApN確實存在調節骨細胞和骨量的作用，然而具體的作用機制還未有報道。

BMSCs是一類具有多向分化能力的原始骨髓細胞，可修復受損骨組織，維持骨組織代謝平衡[1]。研究[18]表明，BMP信號通路在BMSCs分化中發揮重要作用。BMP2是成骨過程中的關鍵調節因子，BMP2通過與靶細胞上的I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，進而磷酸化下游的Smad1/5/9，磷酸化的Smads可與Smad4結合形成復合物，易位進細胞核內，調節RUNX2和Osx等靶基因[19]。然而RUNX2是成骨分化所必需的轉錄因子，可調節成骨特異性標志物ALP、Col I和OCN等的表達[20]。Qiu等[21]在研究微管微絲交聯因子1(microtubule actin cross-linking factor 1, Macf1)在骨形成和成骨分化中的功能和機制時，發現敲低Macf1抑制Bmp2/Smad/RUNX2信號通路，下調ALP、Col I和OCN表達，抑制骨形成和成骨分化。因此BMP2及BMP通路作用ALP在骨形成和骨分化中發揮著重要作用。

ALP是成骨分化的早期標志物[22]，在本研究中，我們首先用茜素紅染色和ALP染色評估了ApN對BMSCs成骨分化的影響。研究結果顯示，過表達ApN增強了BMSCs中鈣化沉積，ALP陽性表達也增多；而干擾ApN表達則顯示出相反的結果，這表明ApN可促進BMSCs的成骨分化。為探討BMP通路是否也參與ApN介導的BMSCs成骨分化，我們也檢測了BMP信號通路及成骨相關基因的表達。研究結果顯示，過表達ApN上調BMSCs中BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表達；干擾ApN表達下調BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表達。這表明ApN可能是通過激活BMP信號通路發揮促進BMSCs成骨分化的作用。有研究[23]發現，枸杞多糖在缺氧條件下增強了BMSCs的成骨細胞分化，并認為其作用機制為增強了BMSCs中Runx2和ALP的表達。Yuan等[24]證實了新橙皮苷促進小鼠骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化，增強堿性磷酸酶活性，上調成骨細胞標志物的表達與新橙皮苷作用BMP2-Wnt/β-catenin通路的作用機制相關。本研究僅在細胞水平初步探討了ApN對BMSCs成骨分化的作用和機制，然而ApN對BMP信號通路的調控具體的關鍵靶點是什么尚不清楚，仍需進一步研究。

綜上所述，ApN可通過BMP信號通路促進BMSCs成骨分化。這為BMSCs用于治療骨損傷提供了一定的理論基礎。