骨痿不同中醫(yī)證型中血瘀與PPARγ、Runx2相關(guān)性研究

陳德駿 梁祥翰 黃宏興 朱根福 黃幸儒 方堅廖榮臻*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(廣東省中醫(yī)骨傷研究院)，廣東 廣州 510378

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種普遍的全身性代謝性骨病，其主要機制是骨形成和骨吸收之間的穩(wěn)態(tài)遭到破壞，導(dǎo)致骨重建的失衡[1]。中醫(yī)稱之為“骨痿”。近年來，骨痿已成為影響我國中老年人生活的主要骨骼疾病之一，提早防治刻不容緩。既往的研究[2]發(fā)現(xiàn)，PPARγ、Runx2在骨質(zhì)疏松癥的代謝平衡中起著重要作用。一項動物實驗研究[3]發(fā)現(xiàn)，PPARγ缺失小鼠模型表現(xiàn)出骨量增加，表明PPARγ與成骨分化呈負相關(guān)。此外，Runx2通過與hedgehog、Wnt信號分子以及Dlx5、Sp7等轉(zhuǎn)錄因子，相互調(diào)控成骨細胞的增殖、分化來抑制破骨形成，從而促進成骨，維持機體骨穩(wěn)態(tài)，防止骨量丟失[4-5]。目前在中醫(yī)藥普遍運用于防治骨質(zhì)疏松下，血瘀在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，活血化瘀藥在調(diào)節(jié)骨代謝改善骨質(zhì)疏松方面發(fā)揮獨特優(yōu)勢，但其分子途徑尚不明確。有研究[6]報道PPARγ、Runx2信號通路通過MAPK磷酸化，而MAPK途徑是血瘀形成重要通路，同時有關(guān)PPARγ、Runx2的表達與骨痿不同中醫(yī)證型中血瘀的相關(guān)性研究鮮見報道。因此，本研究對不同中醫(yī)證候類型的骨痿患者進行上述指標的對比研究，旨在探討骨痿患者不同中醫(yī)證候類型的PPARγ、Runx2表達情況及其與血瘀內(nèi)在聯(lián)系，對于進一步認識骨痿患者血瘀的發(fā)生機理及指導(dǎo)中醫(yī)藥精準靶藥治療具有重要意義。總結(jié)報告如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料

2019年1月至2021年1月期間，收集在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)中心基于骨密度檢測，診斷為骨痿，計劃因合并髖關(guān)節(jié)病行人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)治療的病例。該試驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查并批準實施(2020036)。

1.2 骨質(zhì)疏松癥(骨痿)標準

根據(jù)《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(2020)》[7]及王少山等主編《骨病中西醫(yī)診療學(xué)》[8]中骨質(zhì)疏松癥(骨痿)擬定的標準。

1.2.1骨痿診斷標準：依據(jù)全身雙能X線骨密度儀(DXA)測定腰椎1～4及股骨頸骨密度T值≤-2.5，確診為骨痿。

1.2.2中醫(yī)證候標準：①脾腎陽虛證：腰膝酸軟、或五更泄、或腹部冷痛，舌淡、苔白或厚膩，脈沉弱等；② 肝腎陰虛證：口干舌燥，腰膝酸軟，潮熱盜汗，舌紅少苔，脈細數(shù)等；③氣滯血瘀證：腰背酸脹，骨節(jié)刺痛，疼痛固定，舌紫暗，或瘀斑，脈細澀等。

1.2.3納入標準：①以DXA測定腰椎1～4及股骨頸骨密度的T值≤-2.5；②確診為骨痿(骨質(zhì)疏松癥)；③年齡：60～80歲；④合并髖關(guān)節(jié)病，擬行人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)治療的患者。

1.2.4排除標準：①非骨痿患者；②患者<60歲或>80歲；③合并如代謝性骨病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病累及關(guān)節(jié)者；④患有嚴重原發(fā)性疾患如心血管病及精神病者等。

1.3 方法

1.3.1骨密度檢測：入院第二天所有病例的腰椎及股骨頸骨密度值均通過全身雙能X線骨密度儀(Unigamma X Ray Plus，意大利)檢測。

1.3.2辨證分型：由3名主任中醫(yī)師參考《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(2020)》[7]以及王少山主編《骨病中西醫(yī)診療學(xué)》[8]獨立對符合納入標準病例進行中醫(yī)辨證分型，最終納入病例分型為肝腎陰虛型、脾腎陽虛型、氣滯血瘀型3種證型。予以剔除辨證分型過程3者結(jié)論差異較大的病例。

1.3.3主要試劑與器材：抗體PPARγ (批號：sc-7273，美國Santa公司)；抗體Runx2、GAPDH(批號：12556，5174，美國Cell Signaling Technology公司)；PVDF膜(型號：ISEQ00010，美國Millipore公司)；電泳儀(JS-Power300，上海培清科技有限公司)；全自動生化分析儀(型號：C16000，美國雅培公司)。

1.3.4血液指標測定：入院第二天晨起，抽取入組病例空腹外周靜脈血，以全自動生化分析儀檢測相關(guān)凝血指標：凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(Fbg)及D-二聚體(D-D)。

1.3.5Westernblot檢測：患者充分了解研究方案，并自愿簽署知情同意書，入院第三天行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)時留取股骨頸髓腔開路的松質(zhì)骨標本，保存于-80 ℃低溫環(huán)境。再以Western blot蛋白印記法檢測不同證型骨痿患者松質(zhì)骨標本中PPARγ、Runx2蛋白的表達。用PBS干預(yù)后洗滌2次，加入RIPA裂解緩沖液裂解細胞，提取蛋白，采用SDS-PAGE進行電泳分離，選取PVDF膜，然后將目標蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，置于TBST(含5 %脫脂牛奶)中，室溫封閉 2 h；使用相應(yīng)的一抗及二抗檢測，包括抗PPARγ、抗Runx2、抗GAPDH抗體及對應(yīng)二抗。蛋白質(zhì)以ECL發(fā)光試劑法檢測，每個條帶代表蛋白的表達量的吸光度值以凝膠分析軟件測定。最終以蛋白表達量與內(nèi)參GAPDH表達量的比值作為本研究的觀察指標。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料比較

本研究共94例患者符合納入標準。通過辨證分析和證素提取，將納入患者辨證為肝腎陰虛型39例、脾腎陽虛型30例、氣滯血瘀型25例。3種證型患者的基線水平均衡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 3種癥候類型骨痿患者的基線資料

2.2 3種證候類型骨痿患者的凝血功能比較

3種癥候類型骨痿患者的血清PT、TT、Fbg水平相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。氣滯血瘀型骨痿患者的血清APTT及D-D水平相比肝腎陰虛型及脾腎陽虛型骨痿患者血清APTT及D-D水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：*P<0.05，**** P<0.0001。圖1 3種癥候類型骨痿患者的凝血功能檢測結(jié)果Fig.1 Results of coagulation function test in patients with three syndrome types of flaccidity of bones

2.3 3種證候類型骨痿患者的松質(zhì)骨PPARγ、Runx2蛋白比較

相比肝腎陰虛型及脾腎陽虛型骨痿患者的松質(zhì)骨PPARγ蛋白水平，氣滯血瘀型骨痿患者的松質(zhì)骨PPARγ水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相比肝腎陰虛型骨痿患者的松質(zhì)骨Runx2蛋白水平，脾腎陽虛型及氣滯血瘀型骨痿患者松質(zhì)骨的水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。氣滯血瘀型骨痿患者的松質(zhì)骨Runx2蛋白水平相比脾腎陽虛型骨痿患者松質(zhì)骨其蛋白水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，圖2。

注：*P<0.05，**** P<0.0001。圖2 各組骨痿患者松質(zhì)骨PPARγ、Runx2蛋白表達的比較Fig.2 Comparison of PPARγ and Runx2 protein expression in cancellous bone of patients with flaccidity of bones among all groups

圖3 各證候類型骨痿患者松質(zhì)骨Western印跡比較Fig.3 Comparison of Western blotting results of cancellous bone in patients with different syndrome types of flaccidity of bones

3 討論

骨質(zhì)疏松癥在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中并無病名，由于其病因病機、臨床表現(xiàn)和體征，中醫(yī)將其歸類為“骨痿”的范疇。《素問·痿論》有云：“腎主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓消，發(fā)為骨痿”。古人認為，腎臟負責(zé)藏精及化生骨髓，腎精的盛衰與骨的強度密切相關(guān)。腎精豐盈時，骨髓生化有源；腎熱精傷，則導(dǎo)致骨髓生化之源受損，故發(fā)為骨痿。此外，飲食不節(jié)，久之脾胃功能衰弱，運化無力，氣血無源無以滋腎充骨，精傷髓減，也可致骨痿。如《金匱要略》說：“咸則傷骨，骨傷則痿”。而王清任在《醫(yī)林改錯》亦指出“元氣既虛……血管無氣，必停留而瘀”。血瘀是骨痿的主要病因病機之一，隨著年齡的不斷增長，元氣漸虛，血行無力，淤血阻于骨絡(luò)，骨髓失養(yǎng)，出現(xiàn)骨骼脆弱乏力，同時氣血運行失于通暢，臟腑失養(yǎng)，加重本虛，兩者互為因果，漸而形成骨痿。所以，骨痿的形成主要在于脾、腎、血瘀。對此，趙宇等[9]認為骨痿之本在于腎虛，兼見肝脾虧虛，其標在于血瘀，其中腎虛與血瘀互為因果。萬雷等[10]指出，血瘀理論、腎主骨理論、脾腎相關(guān)理論是黃宏興教授治療骨痿的基礎(chǔ)理論。可見，脾、腎、血瘀與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，3者皆是骨痿發(fā)生與發(fā)展極其重要的因素。

現(xiàn)代研究認為骨質(zhì)疏松癥主要是與成骨細胞的分化缺陷和脂肪生成增加密切相關(guān)[11]。骨髓間充質(zhì)干細胞受兩個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和Runx2調(diào)節(jié)，分化脂肪細胞和成骨細胞形成脂肪和骨。PPARγ是調(diào)節(jié)脂肪細胞生成與分化的關(guān)鍵因子，也是抑制成骨分化程序的轉(zhuǎn)錄因子[12]。而Runx2在調(diào)節(jié)成骨細胞分化方面至關(guān)重要，是成骨細胞分化所必需的一種轉(zhuǎn)錄因子。PPARγ和Runx2調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞、破骨細胞或脂肪細胞，而骨代謝的平衡又取決于成骨細胞和破骨細胞的分化和調(diào)節(jié)[13]。以往研究已證實PPARγ能抑制Runx2的表達，進而抑制其成骨基因的表達，所以抑制PPARγ活性與增強成骨密切相關(guān)[14-15]。如果PPARγ長期屬于被激活狀態(tài)，通過抑制Runx2基因啟動子的啟動，可以干擾Runx2的轉(zhuǎn)錄和表達，降低成骨細胞水平，最終使骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞大量分化，導(dǎo)致骨內(nèi)壓增高，血液回流障礙，使得成骨分化不足，最終引起骨質(zhì)流失、骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病[16-17]。本研究結(jié)果顯示，氣滯血瘀型骨痿患者的PPARγ蛋白表達水平高于肝腎陰虛型及脾腎陽虛型，表明氣滯血瘀型患者可能較其他證型存在較高骨量丟失。近年來已有臨床研究證實了這一點，張鵬等[18]研究發(fā)現(xiàn)骨痿氣滯血瘀型患者較腎陽虛衰型、肝腎陰虛型存在較高骨代謝水平。李小圳等[19]同樣發(fā)現(xiàn)在241例患者中81例氣滯血瘀型與其他證型相比，骨密度平均值T最低(-3.03)。而與本研究中氣滯血瘀型存在Runx2和PPARγ同樣高表達似乎矛盾，其中因素可能與破骨細胞分化增加，機體保護性應(yīng)激反應(yīng)增強Runx2表達來增強成骨細胞分化，實現(xiàn)骨重塑的平衡有關(guān)，但骨痿患者骨髓成脂能力更強[20]，同時也可能與骨髓脂肪細胞分泌脂聯(lián)素、瘦素等脂肪因子有關(guān)，有研究[21]顯示，這些因子對骨量影響是雙向的，通過相關(guān)分子通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。

血瘀既是骨痿發(fā)生的重要因素，又是骨痿病理產(chǎn)物。血瘀形成可引起骨微循環(huán)障礙，導(dǎo)致成骨細胞和破骨細胞代謝功能絮亂，減緩新骨合成和舊骨吸收速度，造成骨重建失衡，從而引發(fā)或加重骨質(zhì)疏松[22-23]。為了進一步驗證不同證型骨痿患者的PPARγ、Runx2相關(guān)表達與血瘀是否具有一定的相關(guān)性，本研究進行3種證型骨痿患者的凝血功能比較，結(jié)果表明，氣滯血瘀型骨痿患者的血清APTT及D-D水平明顯高于其他兩種證型，表明氣滯血瘀型骨痿患者的PPARγ、Runx2高表達與血瘀具有一定的相關(guān)性。這可能與MAPK途徑激活是血瘀形成的重要通路及PPARγ、Runx2表達依賴MAPK途徑磷酸化有關(guān)。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)Runx2和PPARγ通過MAPK依賴的磷酸化而調(diào)節(jié)機體，而MAPK途徑激活最終誘導(dǎo)凝血因子表達及脂質(zhì)代謝絮亂[24-25]。一方面，通過MAPKs信號通路中p38 MAPK、JNK及ERK蛋白磷酸化水平會對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生影響，尤其p38 MAPK，p38 MAPK的激活，導(dǎo)致cAMP水平下降，上調(diào)P-選擇素的表達以及抑制aIIBβ3激活，從而刺激血小板活化，促進血栓的形成[26]。另一方面已證實脂質(zhì)代謝絮亂是構(gòu)成微循環(huán)障礙的重要高危因素，PPARγ通過MAPK途徑磷酸化致使脂質(zhì)累積，可相繼引起血管內(nèi)皮損傷、動脈粥樣硬化、增加血液黏稠等一系列血管病變及血流動力學(xué)改變，這些改變?nèi)缪軆?nèi)皮損傷可促使組織因子(TF)釋放，啟動相關(guān)凝血機制，進而啟動血液凝固級聯(lián)反應(yīng)，促進血栓形成[25,27-29]。目前關(guān)于PPARγ、Runx2的表達與血瘀相關(guān)性研究較少，而兩者是否通過MAPK途徑或者其他分子通路干預(yù)血瘀形成，本研究將在下一步課題深入研究證實。

綜上所述，本研究通過骨痿患者松質(zhì)骨PPARγ、Runx2蛋白表達及凝血功能結(jié)果，初步探討了患者PPARγ、Runx2與肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、氣滯血瘀證3種證型表達差異性及與凝血指標的相關(guān)性，進一步明確不同證型骨痿的蛋白表達情況以及血瘀在骨痿的發(fā)病過程中的重要作用，為活血化瘀法及中藥中分子作用靶點治療骨痿提供一定的辨證施治依據(jù)。