金天格防治肌少-骨質疏松癥的作用機制

馬江濤 黃潤龍 周文明 葉茂林 連曉航,3 李穎 黃紅 黃宏興*

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2. 河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)，河南 鄭州 450046 3. 廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心中醫骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405 4. 廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510375 5. 廣州中醫藥大學護理學院，廣東 廣州 510006

肌少-骨質疏松癥(osteosarcopenia，OS)是一種以骨密度、骨微結構、肌力、肌量和肌肉功能下降為特征的老年綜合征[1-2]。由于肌少癥(sarcopenia，SP)目前尚無統一的診斷標準[3-6]，因此OS的發病率仍不確定。一項包含1 105名65歲及以上老年人的薈萃分析[7]顯示OS的發病率在5 %～37 %，女性比男性的發病率更高。OS引起患者跌倒、骨折、虛弱、致殘率和致死率增加[8-10]，嚴重影響老齡人群的生活質量和人均壽命。

面對OS較高的發病率和嚴重不良健康結局，目前尚無批準治療OS的藥物。OS的非藥物治療主要包括：抗阻和平衡訓練，攝入足量蛋白質、維生素D、鈣、肌酸等營養物。OS的藥物治療主要使用抗骨質疏松癥(osteoporosis, OP)的藥物，如地諾單抗、雌激素和選擇性雌激素受體調節劑、睪酮和選擇性雄激素受體調節劑、抗肌抑素抗體和脂肪酸合成酶抑制劑等[1-2,8]，研究者希望通過“老藥新用”來發現抗OP藥物是否具有抗SP的作用，但這需要大量的臨床前研究及高質量的隨機對照試驗來證明。

藥效團模型基于藥效特征元素，預測具有相同藥理作用的化合物的靶點，從而可靠且快速虛擬篩選出特定化合物的靶點，為新藥研發提供重要參考[11-13]。虎骨是一種稀缺名貴的中藥材，具有祛風通絡、強筋壯骨、消炎止痛的功效，長期應用于多個中藥方劑中。然而由于國際公約禁止獵殺售賣虎骨，導致許多含有虎骨的方劑無法應用于臨床。為解決這一難題，中國科研人員采用仿生學研究方法，研制出與野生虎骨在藥理、藥效、安全性等方面基本一致的人工虎骨粉，即金天格膠囊(JTG)[14-16]。JTG明顯改善OP及骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)患者的骨密度、骨代謝、腰背痛及生活質量[17-21]，但對SP的作用未見報道。本研究首先根據高效液相色譜法(HPLC)測定的JTG的成分進行藥效團模型分析，預測JTG 防治OS的可能靶點及通路等。其次構建OS大鼠模型并藥物干預，驗證JTG防治OS的有效性。最后，根據藥效團模型預測出的Akt/NF-κB/Bak信號通路，探討JTG防治OS的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1數據庫及軟件：PubChem數據庫、PharmMapper分析平臺、GeneCards數據庫、OMIM數據庫、TTD數據庫、PharmGkb數據庫、DrugBank數據庫、UniProt知識庫、Bioconductor數據庫、STRING在線網站、Perl軟件、R軟件。

1.1.2主要儀器：電子秤；大小鼠抓力測定儀(山東省醫學科學院設備站，YLS-13A型)；雙能X線骨密度儀(美國Hologic，Discovery A型)；micro CT儀(比利時Scanco Medical)；Bio-Rad電泳儀/轉膜儀；Bio-Rad全能型凝膠成像系統等。

1.1.3動物：6月齡健康雌性SD大鼠60只，SPF級，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號44005800010521。喂食大鼠專用普通飼料及無菌用水。實驗經過廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準并嚴格按照相關實驗動物福利進行(批準號20190429001)。

1.1.4藥品與試劑：地塞米松磷酸鈉注射液(DXM，批號190501，廣州白云山天心制藥股份有限公司)；戊酸雌二醇片(批號523A，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司)；金天格膠囊(批號190912，金花企業股份有限公司西安金花制藥廠)；Western及IP細胞裂解液、電泳液和轉膜液(碧云天)，抗磷酸化Akt抗體(CST)，抗Akt抗體(CST)，抗NF-κB p65抗體(CST)，抗Bak抗體(CST)，抗GAPDH抗體(CST)，抗MuRF1抗體(Santa Cruz)，抗Fbx32抗體(Abcam)，HRP標記的羊抗兔IgG抗體(Abcam)等。

1.2 金天格膠囊(JTG)防治OS的藥效團模型研究方法

1.2.1JTG的高效液相色譜(HPLC)分析：精密稱取氨基酸對照品，加0.1 mol/L鹽酸溶液配成對照品溶液。精密稱取JTG膠囊內容物0.2 g配成供試品溶液。用高效液相色譜法(HPLC)測定每粒膠囊包含的氨基酸。結果表明JTG含有以下17種氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、L-羥脯氨酸(Hypro)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)[22]。

1.2.2JTG所含氨基酸的靶點預測：首先在PubChem數據庫中檢索JTG所含17種氨基酸的2D和3D結構，下載包含3D結構信息的SDF文件。然后將每種氨基酸的3D結構文件上傳PharmMapper分析平臺，預測每種氨基酸的靶點。最后利用UniProt知識庫，為預測出的每個靶點添加基因Symbol，得到JTG所含氨基酸的全部靶點。

1.2.3OS相關靶點選擇：通過Gene Cards數據庫、PharmGkb數據庫、OMIM數據庫、DrugBank數據庫和TTD數據庫，檢索收集與“osteoporosis”、“sarcopenia”和“osteosarcopenia”相關的靶點，將所得OP靶點與SP靶點取交集，并與檢索到的OS靶點取并集得到OS相關的所有靶點。

1.2.4交集靶點的蛋白互作網絡(PPI)構建及核心靶點篩選：將JTG所含氨基酸的靶點與OS相關的靶點取交集，兩者的交集靶點作為JTG防治OS的預測靶點。將預測靶點導入STRING在線網站，限定研究種屬為智人，其他為默認設置，得到PPI網絡。

1.2.5交集靶點的GO和KEGG富集分析：利用R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包，設定閾值P<0.05，對中藥-疾病的交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.3 金天格防治OS的動物實驗研究

1.3.1分組、造模及給藥：SD大鼠隨機分為5組，即正常組(Control)、假手術組(Sham)、OS模型組(OS)、OS金天格組(OS+JTG)和OS雌二醇組(OS+E2)。其中模型組切除雙側卵巢，Sham組切除卵巢附近同樣大小脂肪。術后大鼠連續3 d肌肉注射青霉素鈉(8萬單位/只)防感染。1周后模型組大鼠連續2周腹腔注射DXM [1 mg/(kg·d)]。3個月后，開始藥物干預。OS+JTG組每天灌胃0.375 g/kg金天格，OS+E2組每天灌胃0.104 mg/kg戊酸雌二醇片。其他組每天給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，連續用藥3個月。

1.3.2大鼠腓腸肌、比目魚肌、股骨、子宮、肝臟和腎臟濕重測量：灌胃3個月后，開始取材。完整分離大鼠腓腸肌、比目魚肌、股骨、子宮、肝臟和腎臟等，預冷PBS漂洗后，吸水紙吸除表面水分，分析天平測量濕重，多聚甲醛固定。

1.3.3大鼠體重、前肢抓力及體成分檢測：每周定時測量大鼠的體重及前肢抓力。大鼠前肢抓力測量采用YLS-13A大小鼠抓力儀。測量前，讓大鼠在抓力儀上適應3 min。測量時，當大鼠前爪抓緊抓力桿時，輕握鼠尾水平向后拉，記錄抓力儀上的最大讀數，測量3次取平均值。取材前，雙能X線骨密度儀(DXA)檢測大鼠的體成分，計算大鼠骨骼肌質量指數(SMI，全身瘦肉量/體重)，骨礦含量百分比(BMC，骨礦含量/體重)和脂肪含量百分比(FAT，脂肪含量/體重)。

1.3.4大鼠全身及局部骨密度、股骨骨微結構檢測：取材前，DXA測量大鼠全身骨密度(bone mineral density，BMD)。取材后，測量離體股骨的全長、股骨頭、股骨近端、股骨干和股骨遠端BMD。然后對離體左側股骨遠端進行micro CT掃描，掃描條件為55 kV和145 mA。首先運用儀器自帶分析軟件NRecon和DataViewer將所有掃描圖像保存為水平位、冠狀位和矢狀位。其次運用CTAn軟件選擇股骨遠端生長板上方1 mm的松質骨作為感興趣區，對感興趣區進行骨微結構檢測。骨微結構檢測參數包括：骨體積分數(BV/TV，%)、骨表面積和體積比(BS/BV，mm-1)、骨表面密度(BS/TV，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)、骨小梁分離度(Tb.Sp，mm)和骨小梁數量(Tb.N，mm-1)。最后通過儀器自帶分析軟件(CTvox)重建股骨遠端三維圖像。

1.3.5大鼠腓腸肌Akt/NF-κB/Bak信號通路相關蛋白檢測：灌胃3個月后，麻醉大鼠。迅速完整分離右側腓腸肌，剔除干凈周圍軟組織，預冷PBS漂洗后，超低溫冰箱凍存。粉碎腓腸肌組織，裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。配制分離膠及濃縮膠、電泳液及轉膜液，上樣、電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉。p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、Bak(1∶1 000)、MuRF1 (1∶1 000)、Fbx32 (1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)按照說明書要求配制并4 ℃孵育過夜。配制HRP標記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育二抗1 h，利用全能型凝膠成像系統顯影。

1.4 統計學處理

圖1 金天格的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography chart of JTG

2 結果

2.1 金天格膠囊(JTG)防治OS的藥效團模型研究結果

2.1.1JTG所含氨基酸和OS的靶點篩選結果：在PubChem數據庫中檢索JTG所含17種氨基酸的2D和3D結構，得到17種氨基酸的三維結構(圖2A)。利用PharmMapper篩選后，剔除重復靶點，得到401個靶點，分別是：天冬氨酸(Asp)66個、谷氨酸(Glu)71個、L-羥脯氨酸(Hypro)34個、絲氨酸(Ser)44個、甘氨酸(Gly)1個、組氨酸(His)72個、精氨酸(Arg)68個、蘇氨酸(Thr)56個、丙氨酸(Ala)0個、脯氨酸(Pro)2個、酪氨酸(Tyr)79個、纈氨酸(Val)35個、蛋氨酸(Met)71個、異亮氨酸(Ile)82個、亮氨酸(Leu)70個、苯丙氨酸(Phe)63個、賴氨酸(Lys)77個。

檢索五大疾病數據庫與OP、SP和OS疾病相關靶點后，得到198個OS相關的靶點。

2.1.2靶蛋白相互作用網絡構建及核心靶點篩選結果：將198個OS疾病靶點與401個JTG中藥靶點一一映射后，得到10個中藥疾病交集靶點(圖2B)。從10個交集靶點的PPI網絡圖及柱狀圖(圖2C和2D)可知，EIF4EBP1、TP53和IGF1R位于網絡的核心，鄰接節點數目最多，可能為JTG防治OS的核心基因。

2.1.3交集靶點的GO功能和KEGG通路富集分析：GO功能富集分析主要從生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)(圖2E和2F)3個方面闡釋10個交集靶點可能具有的生物學功能。KEGG通路富集分析表明：PI3K-Akt信號通路、凋亡信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等與JTG防治OS的交集靶點的相關性明顯，見圖2 G和2H。

注：A：JTG所含17種氨基酸的三維結構；B：JTG與OS交集靶點的韋恩圖；C：蛋白互作網絡(PPI)；D：核心靶點篩選的柱狀圖；E：GO條圖；F：GO氣泡圖；G：KEGG條圖；H：KEGG氣泡圖。圖2 金天格膠囊(JTG)防治OS的藥效團模型分析Fig.2 The pharmacophore model analysis for the effect of JTG on the prevention and treatment of OS

2.2 金天格防治OS的動物實驗研究結果

2.2.1大鼠子宮、肝臟、腎臟、左側腓腸肌及比目魚肌濕重比較：與Control組和Sham組相比，OS組、OS+JTG組和OS+E2組大鼠的子宮和腎臟濕重明顯下降，肝臟和比目魚肌濕重無明顯變化，表明子宮萎縮明顯，去勢聯合地塞米松引起大鼠子宮萎縮，造模成功。與Control組相比，OS+E2組大鼠的腓腸肌濕重增加，OS+JTG組的腓腸肌濕重無明顯變化，見圖3A～3E。

注：A：子宮濕重比較；B：肝臟濕重比較；C：腎臟濕重比較；D：左側腓腸肌濕重比較；E：左側比目魚肌濕重比較；F：大鼠體重從造模開始前(T0)，灌胃前(T1)，到取材前(T2)的變化；G：大鼠前肢抓力隨著時間的變化；H：大鼠前肢抓力在T0和T2的變化；I：大鼠骨骼肌質量指數(SMI)比較；J：大鼠骨礦含量比較；K：大鼠脂肪含量比較。圖3 金天格改善OS大鼠前肢抓力和體成分Fig.3 JTG improved forelimb grip and body composition in OS rats

2.2.2大鼠體重、前肢抓力及體成分檢測結果：從造模開始前(T0)、灌胃前(T1)，到取材前(T2)，各組大鼠的體重隨著時間增加，各組間體重無明顯差別。從T0到T1，大鼠前肢抓力隨著時間增加；從T1到T2，藥物干預組大鼠前肢抓力較其他組明顯增加，表明JTG和E2明顯提升OS大鼠前肢抓力。與Control組和Sham組相比，OS組大鼠SMI和BMC明顯降低，FAT明顯增加。與OS組相比，JTG和E2明顯提升OS大鼠的SMI和BMC，降低FAT，見圖3F～3K。

2.2.3大鼠骨密度、骨微結構比較：與Control組和Sham組相比，OS組大鼠的全身、股骨、股骨近端、股骨干和股骨遠端骨密度均明顯下降，股骨頭骨密度無明顯變化。與OS組相比，JTG和E2明顯提高OS大鼠的全身骨密度，其他局部骨密度無明顯變化，見圖4A～4F。

注：A：全身骨密度；B：股骨全長骨密度；C：股骨頭骨密度；D：股骨近端骨密度；E：股骨干骨密度；F：股骨遠端骨密度。圖4 金天格改善OS大鼠的骨密度Fig.4 JTG improved bone mineral density in OS rats

與Control組和Sham組相比，OS組大鼠的骨微結構破壞嚴重。與OS組相比，JTG和E2明顯改善OS大鼠的骨微結構，表明去勢聯合地塞米松使股骨遠端松質骨明顯骨質疏松，而JTG和E2明顯逆轉這一病變，股骨遠端三維重建圖形也證明了這一點，見圖5A～5G。

注：A：骨體積分數；B：骨表面積和體積比；C：骨表面密度；D：骨小梁厚度；E：骨小梁分離度；F：骨小梁數量；G：股骨遠端三維重建圖形。圖5 金天格改善OS大鼠的股骨遠端骨微結構Fig.5 JTG improved bone microstructure of the distal femur in OS rats

2.2.4大鼠腓腸肌Akt/NF-κB/Bak信號通路相關蛋白檢測結果：與Control組、Sham組和OS組相比，OS+JTG組和OS+E2組大鼠腓腸肌p-Akt和NF-κB蛋白表達明顯增加，促凋亡蛋白Bak和骨骼肌萎縮相關蛋白Fbx32表達明顯降低，表明JTG和E2激活OS大鼠腓腸肌Akt/NF-κB/Bak信號通路，抑制骨骼肌萎縮相關蛋白Fbx32表達，見圖6。

3 討論

中醫無OS病名，但根據本病的定義，本病當屬“骨肉不相親”范疇。脾虛肉痿，腎虛骨痿，脾腎俱虛，骨枯肉痿，發為本病[23-25]。補腎健脾、強肌壯骨，為本病的治則。JTG能否防治OS，目前還未見報道。本研究首先基于HPLC法和藥效團模型，對JTG所含17種氨基酸進行藥效團模型分析，發現JTG防治OS的作用機制可能與PI3K-Akt信號通路、凋亡信號通路等有關。然后利用去勢聯合地塞米松構建OS大鼠模型并藥物干預，從OS表型特征和蛋白組學等方面探討JTG防治OS的效果及作用機制。

目前對于OS大鼠模型的構建方法，國內外報道較少。國外學者嘗試采用早衰型PolgA(D257A/D257A)小鼠[9]、SAMP8小鼠[26]或10月齡雌性大鼠[5]等模擬OS，這些早衰型小鼠或老齡鼠普遍存在造模成本高、周期長、技術復雜等問題，制約其動物模型構建。本研究采用復合造模法(去勢+地塞米松)構建OS大鼠模型，OS大鼠表現為子宮萎縮，前肢抓力、全身骨骼肌質量指數、全身及局部BMD明顯下降，股骨遠端骨微結構破壞嚴重等表型特征，表明去勢聯合地塞米松可成功構建OS大鼠模型。

藥效團模型研究表明JTG可能通過調控PI3K-Akt信號通路和凋亡信號通路等防治OS。JTG灌胃OS大鼠后，大鼠表現為前肢抓力、全身骨骼肌質量指數、全身及局部BMD明顯增加，股骨遠端骨微結構明顯改善等表型特征，表明JTG可有效防治OS。在腫瘤的發病過程中，磷酸化的Akt能抑制細胞的凋亡與自噬，增加細胞增殖，調控細胞能量代謝。蛋白組學顯示，JTG活性成分磷酸化Akt，活化的Akt促進NF-κB蛋白表達，抑制促凋亡蛋白Bak和肌肉萎縮相關蛋白Fbx32蛋白表達，抑制肌肉凋亡和萎縮，表明JTG可能通過激活Akt/NF-κB/Bak信號通路防治OS。

圖6 金天格通過調控Akt/NF-κB/Bak信號通路相關蛋白表達來防治OSFig.6 JTG prevents and treats OS by regulation of Akt/NF-κB/Bak signaling pathway

本研究表明JTG明顯改善OS大鼠的表型特征，作用機制可能與激活Akt/NF-κB/Bak信號通路有關。面對OS無藥可用的窘境，JTG為防治OS帶來了更多選擇，但仍需要更多的臨床前研究及大量隨機對照試驗來進一步明確其效果和作用機制。