NF1致椎體骨質(zhì)疏松并脊柱畸形的基礎(chǔ)研究

李鵬飛 周林 賈楠 張為 何玉秀* 王金星

1. 河北師范大學(xué)體育學(xué)博士后流動(dòng)站，河北 石家莊 050024 2. 河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院骨科中心，河北 衡水 053000 3. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱科，河北 石家莊 050051

NF1脊柱營(yíng)養(yǎng)不良性改變包括椎體骨量減少、局部骨質(zhì)疏松、椎體后緣扇形變、重度椎體旋轉(zhuǎn)、楔形變、高度丟失、椎管擴(kuò)大、神經(jīng)根管擴(kuò)大、椎弓根間距增寬、變異、椎旁腫塊生長(zhǎng)、橫突紡錘形變和肋骨帶狀改變并扭曲旋轉(zhuǎn)[1-2]。這些變化主要由NF1產(chǎn)生局部活性物質(zhì)及激素誘發(fā)。由于缺少相關(guān)動(dòng)物模型，NF1患者椎體骨質(zhì)疏松并脊柱畸形的病理學(xué)研究進(jìn)展緩慢[3]。營(yíng)養(yǎng)不良性椎體骨質(zhì)疏松和脊柱畸形等病理改變是由于原發(fā)性椎體骨骼發(fā)育不良？還是椎間孔或鄰近組織內(nèi)神經(jīng)纖維瘤繼發(fā)病變？目前仍存有爭(zhēng)議[4]。部分NF1基因缺失小鼠模型不能充分用于骨病研究，是由于心內(nèi)膜過(guò)度增殖和過(guò)早凋亡使心臟發(fā)育中斷導(dǎo)致胚胎死亡[5]。雖然部分NF1鼠類(lèi)模型可顯現(xiàn)一定程度骨骼疾病，且類(lèi)似于人類(lèi)NF1患者；然而沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道此類(lèi)模型出現(xiàn)椎體骨量減少及脊柱畸形，即不能復(fù)現(xiàn)人類(lèi)NF1患者主要骨骼缺陷[6]。本課題應(yīng)用不同基因型NF1小鼠模型實(shí)驗(yàn)，明確NF1致局部骨量減少并伴隨多發(fā)性脊柱缺陷的病因，并解釋其原發(fā)性與繼發(fā)性改變，觀察Nf1flox/-;Col2.3Cre+基因型小鼠脊柱骨骼特征，為深入研究NF1致椎體骨質(zhì)疏松及脊柱畸形的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

WT、Nf1+/-基因型小鼠源自麻省理工學(xué)院(Cambridge, MA, US)。Nf1flox/flox基因型小鼠由德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心提供。培育Col2.3cre轉(zhuǎn)基因小鼠。將成年Col2.3cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26小鼠雜交。PCR檢測(cè)各型小鼠基因，確認(rèn)制備基因型為Nf1flox/flox;Col2.3Cre+、Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠。外周雙能X射線吸收測(cè)定平臺(tái)(peripheral dual-energy X-ray absortiometry, pDXA，PIXImus II; GE-Lunar Corp., Madison, WI)，外周定量計(jì)算機(jī)斷層掃描平臺(tái)(pQCT, Stratec Medizintechnik GmbH, Pforzheim, Germany)，異氟醚(IsoFlo; Abbott Laboratories, North Chicago, IL)，Biopix系統(tǒng)(Bioptics, Inc. Tucson, AZ)，Mtestw R，Image J (NIH, Bethesda, MD, US)等，所有研究均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

1.2 方法

1.2.1X射線攝影及骨密度檢測(cè)：X線數(shù)字?jǐn)z影技術(shù)拍攝正位全長(zhǎng)脊柱X線片。外周雙能X射線吸收測(cè)定法觀察不同基因型小鼠骨量及骨密度(bone mineral density，BMD)。成年小鼠吸入麻醉后進(jìn)行頭部之外的全身掃描，主要觀測(cè)中軸骨中央50 %及腰椎區(qū)域。

1.2.2外周定量計(jì)算機(jī)斷層掃描：將第五腰椎(L5)置于外周定量計(jì)算機(jī)斷層掃描平臺(tái)。沿L5椎弓根下緣橫截面掃描，觀察中央椎體區(qū)域。測(cè)量皮質(zhì)骨的體積骨密度(mg/cm3)。計(jì)算椎體及椎管橫截面積比值。

1.2.3成骨樣細(xì)胞分離：首先培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞[7-9]：1月齡小鼠處死后去除肌肉結(jié)締組織，分離椎骨。收集腰椎樣本；恒溫37 ℃旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)40 min，應(yīng)用III型膠原酶(0.1 mg/mL)和2.5 %胰蛋白酶分解組織并提取骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)基加入10 % FBS，沖洗游離細(xì)胞；細(xì)胞懸液通過(guò)70 μm過(guò)濾器篩選去除聚集體。錐藍(lán)染色測(cè)定陰性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4生物力學(xué)測(cè)試：解剖L5椎體，去除軟骨終板及椎間盤(pán)組織并暴露骨面。生物力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行椎體壓縮測(cè)試。速率設(shè)定20 mm/min。峰值負(fù)載為椎體骨折前所承受最大載荷，同時(shí)測(cè)量椎體橫截面積。峰值壓強(qiáng)計(jì)算為：峰值壓強(qiáng)=峰值負(fù)載/椎體橫截面積。

1.2.5成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)：觀察Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠腰椎骨髓中成骨母細(xì)胞數(shù)量；成骨細(xì)胞集落形成單位。檢測(cè)成骨細(xì)胞分化采用茜素紅染色和von Kossa染色；并測(cè)定鈣鹽沉積。飼養(yǎng)1月后處死小鼠，取L1～L5椎體，收集骨髓單核細(xì)胞。采用密度梯度離心法將研碎后椎骨和骨髓細(xì)胞分離[10-12]。分組后采用成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組含2×106/mL骨髓單核細(xì)胞。兩周后進(jìn)行堿性磷酸酶及茜素紅染色。Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。Von-kossa銀法染色并觀察骨髓細(xì)胞成骨分化，記錄細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)情況。

1.2.6組織學(xué)檢查：將6月齡小鼠處死。解剖分離腰椎浸泡于4 %甲醛溶液。隨后置于含10 %乙二胺四乙酸和4 %甲醛溶液中脫鈣4 d。10 %甲醛固定、乙醇分級(jí)脫水后石蠟包埋，制作5 μm切片。獲得L5椎體縱斷面切片，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和MacNeal染色[13]。進(jìn)行破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞計(jì)量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Nf1 flox/-;Col2.3Cre+小鼠椎體發(fā)育不良性椎體高度減小

四組比較，雖然各基因型小鼠腰椎平均高度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1A)，但是Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L5椎體平均高度低于WT、Nf1+/-、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+小鼠(見(jiàn)圖1B、1C、P<0.05)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠營(yíng)養(yǎng)不良性椎體高度減小與NF1致脊柱畸形特點(diǎn)相符合。

注：A：L1～L5椎體平均高度。B：L5椎體平均高度。C：L5椎體X光影像學(xué)測(cè)量。圖1 Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠椎體高度下降Fig.1 Vertebral average height of Nf1flox/-;Col2.3Cre+ mice decreased

2.2 Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L1～ L5椎體骨密度降低

首先測(cè)量4組小鼠完整脊柱骨密度。然后對(duì)L1～L5分別測(cè)量(見(jiàn)圖2A)。結(jié)果示4組小鼠脊柱中軸骨整體骨密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2B)。但腰椎骨密度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L1～ L5區(qū)域骨密度明顯降低(見(jiàn)圖2C，*P<0.05)。

注：A：小鼠中軸骨的骨密度，紅色區(qū)域?yàn)長(zhǎng)1～ L5。B：中軸骨總體骨密度。C：L1～ L5骨密度。圖2 Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L1～ L5骨密度減小Fig.2 L1-L5 BMD of Nf1flox/-;Col2.3Cre+ mice decreased

2.3 Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L5椎體皮質(zhì)骨量和骨密度均降低

Nf1+/-與Nf1flox/flox;Col2.3Cre+小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L5椎體皮質(zhì)骨密度明顯降低(見(jiàn)圖3A、3B，**P<0.05)。同時(shí)，不僅Nf1+/-與Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組與對(duì)照組比較L5椎體皮質(zhì)骨量均下降，且Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠皮質(zhì)骨面積下降更顯著(見(jiàn)圖3C，**P<0.01)。4組椎體面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3D、3E)。但對(duì)比4組C/V值發(fā)現(xiàn)，Nf1+/-、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+、Nf1flox/-;Col2.3Cre+組顯著大于對(duì)照組(見(jiàn)圖3F，*P<0.01)。組間比較，Nf1flox/-;Col2.3Cre+組C/V值顯著大于Nf1+/-、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組(**P<0.01)。因此，Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠模型椎管擴(kuò)大增寬符合NF1患者椎管結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

注：A：L5椎體斷層掃描。B：L5椎弓根下緣皮質(zhì)骨密度。C：L5椎體皮質(zhì)骨面積。D：L5橫截面椎管及椎體結(jié)構(gòu)。E：椎體面積。F：椎管面積與椎體面積比值。圖3 Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠皮質(zhì)骨面積和骨密度均降低。Fig.3 The cortical bone area and BMD of Nf1flox/-;Col2.3Cre+ mice decreased

2.4 Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠椎體承重能力降低

對(duì)4組小鼠L5椎體增大負(fù)載至椎體破裂，觀察受力峰值分布曲線、記錄最大壓力負(fù)荷(見(jiàn)圖4A)，發(fā)現(xiàn)：Nf1+/-組最大壓力負(fù)荷為25 N、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組為24 N、Nf1flox/-;Col2.3Cre+組為20 N，明顯小于對(duì)照組35 N(見(jiàn)圖4B，*P<0.05)。組間比較，Nf1flox/-;Col2.3Cre+組明顯小于Nf1+/-、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組(見(jiàn)圖4B，**P<0.01)。

承受最大壓強(qiáng)比較：實(shí)驗(yàn)組明顯小于對(duì)照組(見(jiàn)圖4C，*P<0.05)。組間比較，Nf1flox/-;Col2.3Cre+組顯著小于Nf1+/-、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組(見(jiàn)圖4C，**P<0.01)。基于上述發(fā)現(xiàn)，Nf1flox/-;Col2.3Cre+組承受最大負(fù)荷及最大壓強(qiáng)均明顯減弱。此結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)中Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠L5皮質(zhì)骨量和骨密度均顯著降低之間存在必然聯(lián)系。

注：A：載荷峰值分布曲線圖。B：最大壓力負(fù)荷。C：最大壓強(qiáng)。圖4 L5椎體峰值壓力與壓強(qiáng)比較Fig.4 Comparison between peak load and stress on L5

2.5 L5椎體組織學(xué)檢驗(yàn)

Nf1+/-、Nf1flox/-;Col2.3Cre+組L5上關(guān)節(jié)突骨陷窩面積顯著大于Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組和對(duì)照組(見(jiàn)圖5A，*P<0.01)。Nf1+/-、Nf1flox/-;Col2.3Cre+組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯多于Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組和對(duì)照組(見(jiàn)圖5B，*P<0.01)；組內(nèi)比較Nf1flox/-;Col2.3Cre+組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯多于Nf1+/-組(見(jiàn)圖5B，**P<0.01)。Nf1flox/-;Col2.3Cre+組成骨細(xì)胞數(shù)量及密度顯著低于對(duì)照組、Nf1+/-組及Nf1flox/flox;Col2.3Cre+組(見(jiàn)圖5C、5 D，**P<0.01)。

注：A：TRAP染色(20×)。B：破骨細(xì)胞區(qū)域面積量化比較。C：MacNeal染色(20×)。D：成骨細(xì)胞定量分析。圖5 Nf1flox/-;Col2.3Cre+組破骨細(xì)胞區(qū)域增加，成骨細(xì)胞數(shù)量減少Fig.5 The area of osteoclasts in Nf1flox/-;Col2.3Cre+ group increased and the number of osteoblasts decreased

2.6 NF1缺失抑制體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞分化

與對(duì)照組相比，Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠骨髓單核細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得成骨細(xì)胞集落形成單位能力顯著降低(見(jiàn)圖6A，**P<0.01)。對(duì)照組茜素紅染色強(qiáng)陽(yáng)性，而Nf1+/-、Nf1flox/flox;Col2.3Cre+、Nf1flox/-;Col2.3Cre+組茜素紅染色減弱(見(jiàn)圖6B，**P<0.01)；并且礦化骨結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少(見(jiàn)圖6C，P<0.01)。表明Nf1+/-和Nf1-/-椎體內(nèi)前成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化及礦物質(zhì)沉積功能受損。而Nf1flox/-;Col2.3Cre+組功能最弱(***P<0.01)。

注：A：堿性磷酸酶染色。B：茜素紅染色。C：Von Kossa染色。圖6 成骨細(xì)胞分化形成抑制實(shí)驗(yàn)Fig.6 Inhibition of differentiation and formation of osteoblasts

3 討論

NF1是一種常見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，由NF1抑癌基因突變引起[14]。脊柱骨量丟失及結(jié)構(gòu)畸形是NF1患者常見(jiàn)骨骼病變表現(xiàn)[15]。目前，由于缺乏合適的動(dòng)物模型，NF1發(fā)生椎體骨骼異常機(jī)制仍不清楚[16-17]。本研究利用基因雜合法，建立Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此NF1小鼠脊椎節(jié)段較短，椎體骨皮質(zhì)和骨量均明顯減少；椎體峰值壓力和峰值負(fù)荷均顯著降低；并復(fù)現(xiàn)出NF1患者椎管擴(kuò)大的腰椎病變特征；組織學(xué)分析顯示小鼠椎體破骨細(xì)胞形成增加，成骨細(xì)胞分化功能減弱。總之，Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠表現(xiàn)出多種腰椎結(jié)構(gòu)和功能異常，再現(xiàn)NF1患者脊柱營(yíng)養(yǎng)不良性改變。此NF1小鼠亦提供了深入了解NF1患者椎體骨質(zhì)疏松及脊柱脊髓功能異常的動(dòng)物模型，為深入研究NF1的病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

目前，NF1致椎體骨骼發(fā)育異常的機(jī)制尚不完全清楚[18]。臨床上，NF1致椎體骨質(zhì)疏松和脊柱畸形進(jìn)展的嚴(yán)重程度，均與椎體特征性形態(tài)發(fā)生改變有關(guān)[19]。而且NF1致脊柱畸形是原發(fā)性骨骼發(fā)育缺陷，還是源自鄰近椎體旁腫瘤影響，目前仍存在爭(zhēng)議[20-22]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)Nf1flox/-;Col2.3Cre+動(dòng)物模型出現(xiàn)椎體骨量明顯減少、破骨細(xì)胞形成增加及成骨細(xì)胞數(shù)量減少，表明脊柱存在原發(fā)性椎體骨骼發(fā)育缺陷[23]。

哺乳動(dòng)物骨骼發(fā)育和重塑是活躍且持續(xù)的過(guò)程，需要破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞互相調(diào)整來(lái)維持體內(nèi)生長(zhǎng)平衡[24-26]。營(yíng)養(yǎng)不良性椎體骨質(zhì)疏松和脊柱畸形等病理改變是由于原發(fā)性椎體骨骼發(fā)育不良？還是椎間孔或鄰近組織內(nèi)神經(jīng)纖維瘤的繼發(fā)性反應(yīng)？結(jié)合此項(xiàng)研究，課題組認(rèn)為是NF1導(dǎo)致了破骨細(xì)胞形成增加和成骨細(xì)胞生成減少。這些細(xì)胞系原發(fā)性病理缺陷可能導(dǎo)致椎體骨量減少和脊柱畸形快速進(jìn)展[27]。亦可解釋NF1臨床特異性表現(xiàn)：包括NF1患者脊柱矯形術(shù)后內(nèi)固定并發(fā)癥及脊柱融合術(shù)后假性關(guān)節(jié)病發(fā)生率均較高[28-30]。

本研究亦存在局限性，實(shí)驗(yàn)中所建立NF1小鼠動(dòng)物模型為四足類(lèi)，脊柱不承擔(dān)縱向壓力，同時(shí)不需要維持脊柱平衡的軸向載荷。但人類(lèi)兩足運(yùn)動(dòng)，脊柱為主要載荷部位。由于兩足類(lèi)脊柱生物力學(xué)情況與四足類(lèi)不同，因此四足動(dòng)物模型不能完全顯示兩足類(lèi)脊柱畸形特征。包括NF1患者特征性扇貝樣改變及脊柱后凸畸形。盡管有條件限制，Nf1flox/-;Col2.3Cre+小鼠與對(duì)照組相比，仍然出現(xiàn)脊柱椎體皮質(zhì)骨發(fā)育異常、骨量減少情況，以及腰5椎管結(jié)構(gòu)增寬并發(fā)育異常。目前課題組亦積極攻關(guān)，擬建立NF1致椎體骨量減少并脊柱側(cè)彎的雙足類(lèi)動(dòng)物模型。

綜上所述，本研究證據(jù)表明NF1中存在原發(fā)性成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞功能缺陷，可能導(dǎo)致NF1患者出現(xiàn)發(fā)育營(yíng)養(yǎng)不良性骨質(zhì)疏松以及多發(fā)性脊柱畸形。該實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究NF1椎體原發(fā)性骨質(zhì)疏松與脊柱形態(tài)學(xué)改變的機(jī)制進(jìn)行鋪墊，為深入了解及治療NF1患者骨質(zhì)疏松及脊柱畸形提供科學(xué)依據(jù)。