miR-124-3p靶向Axin1 調控糖尿病骨質疏松成骨的研究

王斌 麥彩園 汪志中 李新旭 董俊球*

1.佛山市三水區人民醫院骨科，廣東 佛山528100 2.廣東省婦幼保健院產科，廣東 廣州510010

2型糖尿病患者在中國的發病年齡逐漸變小[1]。糖尿病患者常見的一種并發癥為骨質疏松。在骨質疏松的糖尿病患者中，骨微結構受損，骨量減少和脆性骨折增加[2]。越來越多的證據表明，糖尿病會增加患骨質疏松癥骨折的風險[3]。因此，必須開發有效的防治骨質疏松癥的措施來預防和干預[4]。

近年來，miRNA對BMSCs及成骨細胞分化的影響已成為熱點問題, 史宏利等[5]研究人BMSCs中miRNA的表達差異，體外研究證實miR-124-3p對BMSCs向成骨細胞分化起調控作用，在老年小鼠骨組織中也發現miR-124-3p表達上調，該miRNA在骨組織的退化及骨質疏松形成和發展過程中發揮較大作用。研究[6]表明，Wnt通路調節干細胞作用于成骨細胞分化，在糖尿病骨質疏松癥的發生過程中發揮重要作用。BMSCs可激活骨誘導基因然后經過Wnt通路調控誘導骨分化[7]。Wnt的激活可以促進成骨，增加骨量，并促進骨的愈合，Axin1(axis inhibitor factor 1，軸抑制蛋白1)是Wnt/β-catenin通路里Wnt下游一個抑制骨形成的因子，它是一種多功能的構架蛋白，在許多重要的信號傳導通路中扮演著重要的角色。它參與調節許多細胞功能，包括細胞增殖、干細胞再生、細胞凋亡、胚胎發育、代謝、分化和細胞運動[8]。

本研究中建立糖尿病誘導的骨質疏松模型，分析miR-124-3p通過Wnt通路的因子Axin1 對成骨分化產生的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

PCR檢測系統、紫外分光光度計、流式細胞儀：Bio-Rad公司，美國。熒光素酶報告檢測系統、骨密度儀：Progmega公司，美國。Trizol、RT-PCR試劑盒(M-MLV)：碧云天公司，中國。ALP試劑盒、茜素紅染色試劑盒、載體：Bio-Rad公司，美國。檸檬酸鹽緩沖液、鏈脲霉素(STZ)：研謹生物科技有限公司，中國。ELISA試劑盒：Takara公司，中國。培養液、Percoll液、胰酶、抗體、成骨誘導液、LipofectamineTM2000：無錫百邁格生物科技有限公司，中國。堿性磷酸酶染色試劑盒、茜素紅染色溶液、miR-124-3p模擬物：Bio-Rad公司，美國。胎牛血清、p-MiR report質粒、293 T細胞：Invitrogen公司，美國。

1.2 實驗對象

本研究方案經由佛山市三水區人民醫院的倫理委員會審查通過。從中山大學實驗動物中心購買糖尿病大鼠模型-SPF級SD雌性大鼠20只，年齡7～10周，體重130～200 g，分為對照組和實驗組，每組10只。對照組腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液，實驗組注射新鮮制備的2 %鏈脲霉素(STZ)(60 mg/kg)持續1周。空腹12 h后測量血糖，濃度為16.67 mmol/L，表明該模型的成功建立。所有大鼠于8周后被處死，擺鋸于股骨近端1/3處截斷，采集大鼠的骨髓組織及外周靜脈血清，并儲存在-80 ℃。

1.3 實驗過程

20只大鼠分組為對照組10例、實驗組10例，經過藥物注射，ELISA檢測血生化指標，骨密度儀測骨密度。BMSCs培養，流式細胞學鑒定。檢測對照組和實驗組miR-124-3p mRNA的表達。過表達miR-124-3p(模擬物)7、14、21 d，檢測ALP、茜素紅染色成骨能力。第7天檢測miR-124-3p mRNA表達水平。實驗組細胞用miR-124-3p模擬物轉染，分為高糖組和低糖組，檢測中Axin1 mRNA水平。構建載體，與模擬物共轉染，熒光素酶報告基因檢測miR-124-3p和Axin1靶向結合。將實驗組BMSCs分為高糖組和低糖組，檢測實驗組BMSCs高糖組及低糖組miR-124-3p、Runx2 mRNA的表達及茜素紅染色和ALP染色結果。檢測實驗組模擬物在高糖組及低糖組miR-124-3p、Runx2 mRNA的表達及茜素紅染色和ALP染色結果。

1.4 ELISA檢測生化指標

ELISA檢測糖尿病模型大鼠的血清生化指標，β 膠原降解產物(β-CTX)、骨鈣素(OC)、硬化素(SOST)評估骨的吸收和形成；總三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)評估脂質代謝；空腹血糖FPG和血紅蛋白A1C-HBA1C評估葡萄糖代謝；骨密度儀檢測大鼠腰椎骨密度(g/cm2)。驗證糖尿病骨質疏松大鼠模型的有效性。

1.5 BMSCs培養

取骨髓2.5 mL，置于抗凝管中。將骨髓與等體積的含1 %雙抗的培養液混合。離心，去除上清。重懸細胞，緩慢注入Percoll液，離心，吸取中間細胞層，加培養基，吹打混勻于培養箱進行培養。每24 h換液，顯微鏡下觀察細胞。胰酶消化后，調節細胞濃度至2×105個/mL，培養。融合度達到70 %以上，傳至3代。

1.6 BMSCs鑒定

細胞離心，分裝于管中，離心后棄PBS液，保留50 μL，于每管細胞樣品中加的CD34、CD45、CD73、CD105以及單克隆抗體各10 μL，孵育，清洗，重懸細胞，流式細胞儀進行檢測。

1.7 轉染

將轉染模擬物(10 μL)和對照片段(200 nmol)溶解于150 μL光學MEM-細胞培養基中制備模擬混合物。LipofectamineTM2000 (5 μL) 溶解于150 μL的Opti-MEM I(1X)還原血清培養基作為轉染溶液。細胞播種在6孔板，在堿性α-MEM培養基中培養過夜。將轉染溶液和模擬混合物混合，在細胞密度達到80 %混雜度時加入細胞，并孵育20 min。然后將混合物加入細胞中，在37 ℃的5 % CO2環境中孵化，加入無青霉素/鏈霉素的完整培養基2 mL。將實驗組BMSCs分為用30 mmol/L葡萄糖處理的高糖組和用5.6 mmol/L葡萄糖處理的低糖組。將實驗組細胞轉染模擬物(過表達)，同法分高糖組和低糖組。

1.8 RT-qPCR實驗

從BMSCs中用Trizol提取RNA。用Nano-100微量分光光度計進行定量。使用通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)進行反轉錄。GoTaq? qPCR Master Mix(A6002)用于檢測Axin1、Runx2、miR-124-3p的水平。使用Primerpremier5設計引物(表1)。miRNA的相對表達內參為U6，其他的相對表達內參為β-action。

1.9 雙重熒光素酶報告基因檢測

利用http://www.targetscan.org/vert_71/網站預測，miR-124-3p可能結合的Wnt通路靶位點Axin1。構建野生型靶基因3’端非翻譯區熒光素酶報告基因載體pMIR-Axin1-WT及 miR-124-3p 靶序列突變型載體pMIR-Axin1-MT。將實驗組BMSCs細胞接種于24孔板，用Lipofectamine 2000將pMIR-Axin1-WT、pMIR-Axin1-MT熒光報告載體與miR-124-3p 模擬物共轉染到293 T細胞中。雙熒光素酶報告基因系統檢測熒光素酶活性。確定 miR-124-3p 靶向結合基因Axin1。

1.10 堿性磷酸酶(ALP)染色

用堿性磷酸酶染色試劑盒(Bio-Rad公司，美國)進行ALP染色。將細胞植入6孔板，用4 %對甲醛(pH 7.4)固定1～2 min，用磷酸鹽緩沖鹽(PBS)和三緩沖鹽水(TBST)洗滌兩次。加入ALP染色溶液覆蓋細胞，在室溫下陰涼處孵育15～20 min。丟棄ALP染料后，用PBS清洗細胞。然后在孔中添加適當量的PBS，顯微鏡下觀察。在定量分析中，用10 %十二酰氯化吡啶去除ALP染料15 min，并測量在540 nm處的吸光度，然后計算出相對的ALP活性。

1.11 茜素紅染色

將細胞種到6孔板中，4 %的多聚甲醛固定15～30 min。用PBS洗滌細胞3次，加入0.2 %茜素紅染色溶液(pH 8.3)1～5 min。高葡萄糖條件轉染miR-124-3p 模擬物，孵育，在顯微鏡下觀察。然后用20 %甲醇和10 %醋酸的溶液溶解茜素紅染料，并通過測量其在570 nm處的吸光度進行量化。然后計算相對茜素紅染色。

1.12 統計學處理

2 結果

2.1 糖尿病模型大鼠的葡萄糖和脂質代謝

實驗組TG、TC、FPG、HbA1C值上調(圖1 a、b、c、d)，β-CTX和SOST上調，OC和骨密度下調(圖1 e、f、g、h)。

圖1 糖尿病模型大鼠的葡萄糖和脂質代謝、骨密度(*P<0.05)Fig.1 Glucose and lipid metabolism and bone mineral density in diabetic model rats (* P <0.05)

2.2 BMSCs鑒定

流式細胞術分析BMSCs(圖2)：CD73和CD105的表達為陽性，CD34 和 CD45 的表達呈陰性。符合間充質干細胞的抗原特點，證實為BMSCs。

圖2 流式細胞術分析BMSCs的細胞表面標記分子Fig.2 Flow cytometry analysis of BMSCs cell surface marker molecules

2.3 miR-124-3p調控BMSC成骨分化及高糖組中Axin1 RNA表達

對照組和實驗組檢測miR-124-3p表達，實驗組明顯低于對照組(圖 3a)。過表達miR-124-3p(模擬物)7、14、21 d，ALP、茜素紅染色隨時間逐漸升高(圖3b、c)。模擬物轉染后7 d miR-124-3p表達水平顯著升高(圖3 d)。高糖組中Axin1 RNA表達水平上調，但用miR-124-3p模擬物轉染時水平下降(圖 3e)。

注：a：miR-124-3p在實驗組、對照組表達；b、c ：ALP、茜素紅染色；d：模擬物轉染miR-124-3p水平；e：高糖組中Axin1 表達及模擬物轉染時水平；*P<0.05。圖3 miR-124-3p調控BMSCFig.3 MiR-124-3 p regulation of BMSC

2.4 熒光素酶報告基因檢測miR-124-3p和Axin1靶向結合

用數據庫(www.targetscan.org)分析miR-124-3p和Axin1之間的關系，結果表明，miR-124-3p和Axin1具有靶向結合位點(圖4)。

熒光素酶報告基因結果顯示，miR-124-3p可抑制野生型野生型(pMIR-Axin1-WT)的螢光素酶活性，而不影響突變型(pMIR-Axin1-MT)活性(圖4)。

圖4 Targetscan網站證明靶向結合位點，熒光素酶報告基因結果(*P<0.05)Fig.4 Targetscan site proof of targeted binding site, luciferase reporter gene results (*P<0.05)

2.5 高葡萄糖誘導對miR-124-3p表達的影響和成骨性分化

高葡萄糖攝入顯著降低了miR-124-3p、Runx2表達(圖5 a、b)。通過茜素紅染色和ALP染色進行病理分析，發現高糖可抑制成骨分化，減少鈣沉積，減少ALP表達(圖5 c、d)。

圖5 高葡萄糖和低葡萄糖誘導的細胞中的miR-124-3p、 Runx2及成骨的表達水平(*P<0.05)Fig.5 Expression levels of miR-124-3p, Runx2, and osteogenesis in high and low glucose induced cells (*P<0.05)

2.6 高血糖條件下miR-124-3p過表達(模擬物)對成骨分化的影響

Runx2的表達顯示，高糖+對照明顯低于低糖+對照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對照組。茜素紅染色和ALP染色顯示，高糖+對照明顯低于低糖+對照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對照組。

圖6 高血糖條件下miR-124-3p過表達對成骨分化的影響(*P<0.05)Fig.6 Effect of miR-124-3p over-expression on osteogenic differentiation under hyperglycemia (*P<0.05)

3 討論

研究表明miRNA可以調節Wnt通路并參與成骨分化。miR-124-3p可通過調控Wnt通路促進成骨分化[9]。研究[10]發現，糖尿病性骨質疏松癥患者中miRNA的差異會增加骨折的風險，miR-382-3p可以促進骨的形成。有證據[8]表明，Wnt通路及Axin1參與調節許多細胞功能，包括細胞增殖、干細胞再生、細胞凋亡、胚胎發育、代謝、分化和細胞運動。Wnt通路參與了糖尿病性骨質疏松癥的骨骼形成[11]。miR-124-3p參與Wnt通路的調節，通過調節成骨干細胞形態、成骨細胞粘附和成骨細胞的轉錄來參與成骨分化過程[12]。在Wnt信號未被激活時，Axin1作為一個支架蛋白與Gsk-3β和 APC形成降解復合物，降解胞質中的 β-catenin，使其濃度較低。當Wnt被激活時，細胞內DVL募集，DVL拮抗降解復合物的活性可以使β-catenin質內聚積，繼而發生核轉位，在TCF/LEF的作用下，β-catenin引起下游靶基因轉錄[13]。

本研究ELISA檢測血生化指標，實驗組TG、TC、FPG、HbA1C值上調，β-CTX和SOST上調，OC和骨密度明顯下調，驗證了糖尿病骨質疏松大鼠模型建立的有效性。大鼠BMSCs培養后，流式細胞學鑒定，CD73和CD105的表達呈陽性，CD34 和 CD45 的表達呈陰性。符合間充質干細胞的抗原特點，證實為BMSCs。

實驗組miR-124-3p表達明顯低于對照組。過表達miR-124-3p(模擬物)7、14、21 d后，ALP、茜素紅染色隨時間逐漸升高。模擬物轉染細胞后miR-124-3p表達水平顯著升高。證明了糖尿病骨質疏松大鼠股骨miR-124-3p下調，miR-124-3p是一個成骨因子。

實驗組細胞用miR-124-3p模擬物轉染，結果高糖組Axin1 RNA表達水平上調，但用miR-124-3p模擬物轉染時水平下降。用數據庫研究miR-124-3p和Axin1具有靶向結合位點，熒光素酶報告基因結果顯示miR-124-3p可顯著抑制野生型pMIR-Axin1-WT的螢光素酶活性，而不影響突變型pMIR-Axin1-MT熒光報告基因活性。證實了miR-124-3p可靶向調節Axin1，兩者為相反的關系。

RT-qPCR檢測實驗組BMSCs高糖攝入顯著降低了miR-124-3p、Runx2表達；高糖可抑制成骨分化，減少鈣沉積，減少ALP表達。這說明了高糖的成骨抑制性，高糖抑制miR-124-3p及成骨因子。高血糖條件下miR-124-3p過表達(模擬物)中Runx2的表達顯示，高糖+對照明顯低于低糖+對照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對照組。茜素紅染色和ALP染色顯示，高糖+對照明顯低于低糖+對照組；高糖+miR-124-3p模擬物明顯高于高糖+對照組。這說明高葡萄糖的情況下，miR-124-3p過表達可以逆轉BMSC成骨標志物Runx2。茜素紅染色和ALP染色證明，miR-124-3p過表達能恢復高糖對骨發生的抑制作用，同時升高高葡萄糖誘導的鈣沉積和ALP的表達。

總之，本研究證明了 miR-124-3p能通過靶向抑制Axin1促進糖尿病骨質疏松癥大鼠BMSC的成骨發生。本文為臨床治療糖尿病性骨質疏松癥提供了新的理論，我們可以通過調控miR-124-3p及其靶因子Axin1的水平治療糖尿病骨質疏松癥。