槲皮素調控關節炎軟骨細胞膽固醇代謝的機制研究

肖嘉聰 麥嘉樂 張罡瑜 何琪 楊均政 潘兆豐 王海彬

1. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510000 2. 廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心中醫骨傷科實驗室，廣東 廣州 510000 3. 廣州市正骨醫院，廣東 廣州 510000 4. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院關節骨科，廣東 廣州 510000

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是臨床上常見的關節退行性疾病，其主要特征是軟骨破壞、滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨重塑[1-3]。近些年的研究表明，骨關節炎不僅是一種與機械壓力和衰老相關的關節疾病，也是一種與“代謝綜合征”相關的疾病[4]。代謝綜合征包括胰島素抵抗、肥胖、高血壓和血脂異常，其中膽固醇代謝和骨關節炎存在顯著的相關性[5-6]。在骨關節炎期間，軟骨細胞中出現脂質代謝失調和膽固醇累積[7]。Choi等[8]的研究表明，靶向調控 CH25H/CYP7B1/RORα 軸能夠改善關節炎軟骨細胞中的膽固醇代謝，從而減輕骨關節炎。

槲皮素是一種天然存在的黃酮類化合物，存在于大量的水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抑制膽固醇合成等功效[9-11]。槲皮素能夠直接清除自由基、抑制脂質過氧化，減弱促炎細胞因子的表達，并且對新脂肪酸和膽固醇的合成產生快速和直接的抑制作用[12]。有研究表明，槲皮素能夠減輕關節炎小鼠炎癥指數、減輕關節的破壞、發揮抗炎作用[13]。這些證據表明，槲皮素能在骨關節炎的發生和發展中發揮保護作用。

本研究以骨關節炎中的膽固醇代謝為切入點，探討槲皮素是否能夠通過調控骨關節炎軟骨細胞中的膽固醇代謝，減輕軟骨細胞炎癥和細胞外基質降解。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

槲皮素(純度>98 %，CAS：117-39-5)，購自上海源葉生物科技有限公司；IL-1β購自派普泰克生物科技公司；胎牛血清、DMEM/F12 培養基購自賽默飛生物公司；總膽固醇檢測試劑盒購自索萊寶生物科技公司；細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自碧云天生物公司；引物合成由北京擎科生物公司完成，所有引物序列見表1；一抗CH25H、CYP7B 1、RORα、MMP3、MMP13 和β-actin購自美國Abcam公司；二抗購自武漢博士德生物公司。

1.2 小鼠軟骨細胞分離培養及鑒定

從廣州中醫藥大學實驗動物中心[生產許可證號：SYXK(粵)2018-0092]購買3周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，過量麻醉處死。取雙膝關節分離軟骨并剪碎，先用含有0.25 %胰蛋白酶-EDTA的培養基預消化30 min，然后使用含0.1%Ⅱ型膠原酶的培養基消化6 h，離心收集細胞，將細胞培養在含有10 %胎牛血清和1 %抗生素的 DMEM/F12 培養基中。細胞每2天更換1次培養基，當細胞融合至80 %～90 %時進行傳代。P1、P2代軟骨細胞用于后續實驗。軟骨細胞使用甲苯胺藍染色鑒定。

1.3 小鼠軟骨細胞骨關節炎模型建立及分組

本研究使用IL-1β(10 ng/mL)刺激軟骨細胞模擬體外骨關節炎環境。細胞分為對照組、模型組(IL-1β，10 ng/mL)、低濃度組(IL-1β+5 μmol/L槲皮素)、高濃度組(IL-1β+10 μmol/L槲皮素)。

1.4 CCK-8 檢測軟骨細胞增殖

將軟骨細胞接種到 96 孔板(每孔 5×103個細胞)中，細胞貼壁后，在含或不含IL-1β的培養基中加入不同濃度的槲皮素(0、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)干預24 h，干預結束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測波長 450 nm 處的吸光值。

1.5 細胞內總膽固醇(TC)水平檢測

將軟骨細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板，干預 24 h 后按照總膽固醇檢測試劑盒說明書檢測軟骨細胞內膽固醇水平。簡而言之，用異丙醇提取細胞內總膽固醇，超聲裂解，高速離心后取上清，加入檢測工作液，在500 nm處檢測吸光值。制作標準曲線，計算各組細胞內總膽固醇水平。

1.6 qRT-PCR

將軟骨細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板，干預結束后，收集細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，用 PrimeScript RT reagent 試劑盒將 1 μg 總 RNA 反轉錄成 cDNA。采用 SYBR Green 染色法，以各組 cDNA 為模板，加入緩沖液、引物等進行 PCR。采用以下參數進行PCR擴增: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40個循環，最后延伸步驟65 ℃ 5 s，0.5 ℃增量60 s。以18 s為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對mRNA表達量。所有引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 Western blot

將軟骨細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板，干預結束后，收集細胞，加入含 1 %蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液冰上裂解細胞，14 000 r/min離心15 min，取上清，使用BCA Kit(碧云天)檢測蛋白濃度。蛋白樣品和Loading Buffer按照4∶1比例配置，100 ℃加熱5 min，放-80 ℃冰箱儲存以供后續使用。使用10 % SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，隨后轉移到 PVDF膜，用5 %脫脂牛奶于室溫溫下封閉 2 h，加入一抗CH25H、CYP7B1、RORα、MMP3、MMP13、β-actin孵育，4 ℃過夜，TBST 清洗3次，二抗孵育1.5 h，TBST 清洗 3 次，使用凝膠成像儀進行成像。以β-actin作為內參，使用Image J 進行定量分析。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 槲皮素對軟骨細胞增殖的影響

CCK-8結果顯示，10 μmol/L濃度以下的槲皮素對軟骨細胞無毒性，而高濃度(25、50、100 μmol/L)的槲皮素會抑制軟骨細胞增殖(圖1C)。與對照組比較，IL-1β誘導的小鼠軟骨細胞活力受到抑制(P<0.05)，而1、2.5、5、10 μmol/L槲皮素能減輕IL-1β對軟骨細胞的增殖抑制(圖1D)。因此，我們選擇5、10 μmol/L濃度的槲皮素進行后續實驗。

注：與對照組比較，*P<0.05，**** P<0.0001；與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001。圖1 A 槲皮素的化學結構式；B 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞；C槲皮素對軟骨細胞的毒性影響；D 槲皮素對 IL-1β誘導小鼠軟骨細胞增殖的影響Fig.1 A, Chemical structural formula of quercetin; B, Identification of chondrocytes by toluidine blue staining; C, Toxic effect of quercetin on chondrocytes; D, Effect of quercetin on IL-1β-induced chondrocyte proliferation in mice

2.2 槲皮素對軟骨細胞細中總膽固醇水平的影響

結果顯示(圖2)，模型組總膽固醇水平較對照組升高(P<0.05)；與模型組相比，槲皮素干預后的關節炎軟骨細胞內總膽固醇水平有所降低(P<0.05)。這表明，槲皮素能夠調控關節炎軟骨細胞內的膽固醇代謝。

注：與對照組比較，* P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。圖2 槲皮素對IL-1β誘導小鼠軟骨細胞細中總膽固醇含量的影響Fig.2 Effect of quercetin on IL-1β-induced total cholesterol content in fine mouse chondrocytes

2.3 槲皮素對軟骨細胞中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Col2a1、Il-6的mRNA 表達的影響

結果顯示(圖3)，與對照組比較，模型組中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Il-6的mRNA表達均有不同程度升高，而Col2a1的mRNA表達下降；相比于模型組，槲皮素組中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Il-6的mRNA表達有所下降，Col2a1的mRNA表達有所提高。這些結果表明，槲皮素能夠調控CH25H/CYP7B1/RORα信號通路，減輕關節炎軟骨細胞中的炎癥和細胞外基質降解。

注：與對照組比較，** P<0.01，*** P<0.001，**** P<0.0001；與模型組比較，# P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。圖3 槲皮素對軟骨細胞中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Col2a1、Il-6的mRNA表達的影響Fig.3 Effect of quercetin on the mRNA expressions of Cyp7b1, Ch25h, Rorα, Mmp3, Mmp13, Col2a1 and Il-6 in chondrocytes

2.4 槲皮素對 CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3 和 MMP13 蛋白表達的影響

結果顯示(圖4)，與對照組比較，模型組軟骨細胞中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3 和 MMP13 蛋白的表達均有不同程度上升，而槲皮素能夠部分抑制關節炎軟骨細中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3和MMP13的蛋白表達(P<0.05)。這與qRT-PCR的結果一致。

注：與對照組比較，** P <0.01，*** P <0.001，**** P<0.0001；與IL-1β組比較，# P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，#### P<0.0001。圖4 槲皮素對軟骨細胞中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3和MMP13的蛋白表達的影響Fig.4 Effect of quercetin on the protein expressions of CYP7B1, CH25H, RORα, MMP3, and MMP13 in chondrocytes

3 討論

隨著人口老齡化與肥胖人口的增加，骨關節炎的發病率越來越高，隨著病情的進展，晚期骨關節炎的患者只能通過手術來緩解疼痛，這給社會帶來了嚴重的經濟負擔[14-15]。目前，臨床上用于治療骨關節炎的非甾體類抗炎藥和阿片類藥物只能暫時緩解疼痛，并不能延緩骨關節炎的進展[16]。此外，長期服用此類藥物容易導致心血管疾病[17]。因此，努力尋找可以緩解骨關節炎進展的藥物是骨關節炎新藥研發中的重要策略之一。

炎癥和細胞外基質降解是骨關節炎發展的關鍵因素[18-19]。IL-1β會導致促進炎癥因子IL-6的釋放，當炎癥因子不斷釋放時，會引起軟骨細胞功能障礙甚至凋亡，最終導致骨關節炎的發生[20-21]。細胞外基質(ECM)降解會導致關節嚴重疼痛，運動能力喪失，進行性不可逆功能障礙，而基質金屬蛋白酶(MMPs)被認為是細胞外基質降解的關鍵分子[13]。MMP3和MMP13作為關節炎中的兩種關鍵酶，會隨著疾病的進展而表達增高，并不可逆地降解Ⅱ型膠原，造成關節軟骨的破壞和炎癥的發生[22-23]。我們的研究表明，IL-1β誘導后的軟骨細胞中MMP3、MMP13、IL-6的表達均有不同程度上升，Col2a1的表達有所下降；槲皮素處理后部分下調了MMP3、MMP13、IL-6的表達，上調了Col2a1的表達。這表明，槲皮素對關節炎軟骨細胞具有抗炎和延緩細胞外基質降解的作用。

骨關節炎不僅僅是關節軟骨的局限性病變，還涉及全身的代謝異常，特別是膽固醇代謝紊亂，與骨關節炎的發生和發展有著密不可分的關系[24-25]。雖然膽固醇是維持細胞活性和功能不可或缺的物質，但膽固醇的過度累積會抑制軟骨細胞基質的合成和分泌，并破壞細胞膜的結構和功能，導致細胞損傷甚至死亡[26]。綜上所述，膽固醇代謝與骨關節炎的發生和發展密切相關。因此，改善關節炎軟骨細胞膽固醇代謝可能成為治療骨關節炎的新途徑。我們的研究發現，使用IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞中的總膽固醇水平較對照組升高，槲皮素處理后軟骨細胞中總膽固醇水平較模型組降低，這表明槲皮素能夠調控關節炎軟骨細胞內的膽固醇代謝，發揮軟骨保護作用。

細胞內膽固醇累積會導致細胞功能受損，大多數細胞都有嚴格的膽固醇流入和流出系統來防止細胞內膽固醇積累[27]。膽固醇 25-羥化酶(CH25H)和25-羥基膽固醇7α-羥化酶(CYP7B1)是參與膽固醇代謝的重要基因，RORα是維甲酸相關孤兒受體家族成員之一，在炎癥、脂質代謝等方面起重要的作用[8,28]。Li等[29]的研究發現，靶向調控CH25H/CYP7B1/RORα軸能夠直接調節MMP3和MMP13的表達，改善骨關節炎的進展。我們的研究發現，IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞中CYP7B1、CH25H、RORα的基因和蛋白表達均有不同程度上升，而槲皮素降低了它們的表達。這表明，槲皮素能夠抑制關節炎軟骨細胞中CH25H/CYP7B1/RORα信號通路的激活，調節關節炎軟骨細胞中的膽固醇代謝。

綜上所述，我們的研究發現槲皮素能夠改善關節炎軟骨細胞中的膽固醇代謝、炎癥以及細胞外基質降解，這可能是通過調控CH25H/CYP7B1/RORα信號通路來實現的。但是，本研究未能從體內證明這些結果，因此存在一定的局限性，我們將在后續的實驗中為槲皮素治療骨關節炎提供更多的理論支持。