脂多糖對小鼠脛骨骨髓去除后早期骨形成的影響

徐偉 黃晨 謝美明 廖冬發

西部戰區總醫院戰創傷救治中心，四川 成都 610083

骨組織是一種不斷經歷重塑的動態組織，由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收兩個過程維持其動態平衡[1]。炎癥反應與骨穩態維持密切相關[2]。急性炎癥疾病如膿毒血癥和全身多發創傷可導致骨穩態失衡。在骨髓炎、化膿性關節炎和植入物感染等骨科感染患者中，骨吸收增加和骨形成減少是其重要的病理特征[3]。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分。LPS誘導的炎癥模型廣泛應用于抗炎、免疫、損傷等研究[4]。LPS誘導的炎癥模型可以較好的模擬細菌感染過程，其可通過激活破骨細胞中的Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4, TLR4)，導致骨吸收增加，引起骨量丟失和骨破壞[5]。然而，在炎癥性疾病中，LPS對骨形成功能的影響存在矛盾和爭議，同時，LPS對骨形成的影響機制尚未完全闡明[6-9]。

骨髓去除模型(bone marrow ablation, BMX)是一種損傷誘導的骨髓腔內膜內成骨的實驗模型，廣泛用于研究相關生長因子或基因在體內骨形成和骨重建中的作用。BMX后的骨形成過程包括血腫形成、間充質細胞遷移增殖、成骨分化、形成新的骨組織，然后破骨細胞重吸收骨組織和骨髓重建過程，一般在BMX術后1周骨形成達到高峰[10]。本研究中，我們通過建立小鼠脛骨BMX模型，觀察LPS對BMX后早期骨形成的影響并初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2月齡雄性SPF級 C57BL/6J小鼠，飼養于西部戰區總醫院實驗動物中心，重量20～25 g。所有實驗動物的喂養和取材操作嚴格按照西部戰區總醫院實驗動物管理委員會許可進行(批準號：2021EC2-07)，符合動物實驗的倫理要求。

1.2 小鼠脛骨BMX模型制作

參照既往文獻報道的方法制作小鼠脛骨BMX模型[10]。簡而言之，用戊巴比妥鈉(100 mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，取左側膝關節備皮并用碘伏消毒。在膝關節前內側做5 mm皮膚切口，切開髕腱內側的關節囊，使髕骨脫位，暴露脛骨平臺。采用25號注射針頭輕輕扭轉，在脛骨平臺鉆孔，進入骨髓腔。采用27號針頭注射器沿著圓孔插入髓腔后，向脛骨髓腔內快速注射3 mL溫鹽水，去除骨髓。將髕骨復位后，用7-0可吸收縫線縫合關節囊。皮膚用5-0尼龍線縫合。麻醉蘇醒后，所有小鼠都可以自由活動，并在手術后自由進食和飲水。

1.3 LPS腹腔注射

BMX術后24 h，實驗組小鼠給予一次劑量的LPS(0111：B4，Sigma)腹腔注射(10 mg/kg),對照組給予等量PBS腹腔注射。分別于BMX術后4 d或者7 d取材。

1.4 骨組織蘇木精-伊紅(HE)染色和形態計量

骨組織HE染色參照文獻[11]方法進行。簡而言之，脛骨取材后去除肌肉組織，將標本固定于4 %多聚甲醛中24 h，然后采用15 %乙二胺四乙酸進行脫鈣2周。脫鈣后采用標準流程進行石蠟包埋和切片，然后采用蘇木精-伊紅(HE)染色液(碧云天)進行染色。

組織形態計量學分析采用OsteoMeasure(OsteoMetrics, USA)軟件進行，計量參數按照文獻標準[12]進行分析。脛骨中新生骨組織骨體積與組織體積比(bone volume/tissue volume, BV/TV)測量的感興趣區在脛骨近端生長板下方1.5 mm處測量，長度為1.5 mm。

1.5 免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)

參照文獻[10]方法對脛骨脫鈣切片進行IHC染色。本研究使用的特異性抗體如下: b-catenin抗體(1∶200稀釋，CST, 9562 S)，Runx2抗體(1∶100稀釋，Santa Cruz, sc-12488)和PCNA抗體(1∶100稀釋，Santa Cruz, sc-25280)。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-PCR)

采用Trizol試劑(Invitrogen)從小鼠脛骨干組織區域提取總RNA。采用反轉錄試劑盒(大連寶生物)合成 cDNA，根據試劑操作手冊采用定量 PCR 試劑盒進行定量PCR。所有樣本重復3次，采用管家基因(cyclophilinA)為內部參照。定量PCR所用引物如表1。

表1 定量PCR引物Table 1 RT-PCR primers in 5’-3’ direction

1.7 統計學處理

采用 SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計數資料以均數±標準差表示，所有數據經正態性檢驗均符合正態分布，采用獨立樣本t檢驗，采用Levene方差等同性檢驗檢驗方差是否具有齊性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功建立BMX模型

為了排除脛骨干骺端原有骨小梁的干擾，我們選取脛骨干部位進行分析。HE染色顯示，未手術組(Control)脛骨干骨髓腔中充滿核藍染的間充質細胞，幾乎無骨組織(圖1)。BMX術后1周，HE染色顯示，脛骨干骨髓腔中大量新生骨組織占滿骨髓腔(圖1)。上述結果顯示BMX誘導的骨形成模型建立成功。

注：BMX后1周，HE染色顯示脛骨干骨髓腔中充滿新生骨組織，而未手術對照組脛骨干骨髓腔中只有少量骨小梁存在，BMX模型建立成功。bar=100 μm。圖1 建立小鼠脛骨BMX模型Fig.1 Establishment of BMX model in mice tibia

2.2 LPS抑制BMX后早期骨形成

為了研究LPS對BMX骨形成的影響，我們對BMX后1周小鼠脛骨取材，進行組織病理分析。HE染色顯示，LPS處理后脛骨骨髓腔中新生骨組織較對照組減少(圖2A)。進一步采用組織形態計量顯示，LPS處理后新生骨組織BV/TV較對照組顯著減少(圖2B)。上述結果提示LPS抑制BMX后骨形成。

注：A：BMX后1周脛骨干組織病理切片后HE染色，bar=100μm；B：組織形態計量新生骨組織BV/TV。與PBS對照組相比，**P<0.01。圖2 LPS抑制BMX后早期骨形成Fig.2 LPS inhibits bone formation after BMX

2.3 LPS抑制BMX后間充質細胞增殖和成骨分化

為了研究LPS引起BMX后骨形成減少的機制，我們首先檢測了BMX后第4天骨髓腔中間充質細胞增殖情況。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)IHC結果顯示，LPS處理后PCNA陽性細胞較對照組明顯減少(圖3A)，提示LPS抑制BMX后間充質細胞增殖。

進一步我們研究了LPS對BMX后1周成骨分化功能的影響。IHC結果顯示，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中Runx2陽性細胞較對照小鼠明顯減少(圖3B)。RT-PCR結果顯示，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中成骨分化相關標志基因Runx2、Op、Oc和AlpmRNA水平較對照小鼠明顯降低(圖3C)。上述結果提示，LPS處理可以抑制成骨分化。

注：A：BMX后4 d，PCNA IHC染色和PCNA陽性細胞定量；B：BMX后1周，Runx2 IHC染色和Runx2陽性細胞定量；C：BMX后1周，RT-PCR檢測成骨分化相關標志基因Runx2、Op、Oc和Alp mRNA水平。與PBS對照組相比，*P<0.05，***P<0.001，bar=50 μm。圖3 LPS抑制BMX后間充質細胞增殖和成骨分化Fig.3 LPS inhibits mesenchymal cells proliferation and osteogenic differentiation after BMX

2.4 LPS 抑制BMX后經典的Wnt/β-catenin信號

β-catenin IHC結果顯示，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中β-catenin陽性細胞數量較對照小鼠明顯減少。RT-PCR結果顯示，LPS處理小鼠新生骨組織中Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因Lef1、Tcf1、CD44 和CyclinD1 mRNA水平較對照小鼠明顯降低。上述結果提示，LPS 抑制了經典的Wnt/β-catenin信號。

注：A：BMX后1周，β-catenin IHC染色和β-catenin陽性細胞定量。B：BMX后1周，RT-PCR檢測新生骨組織中Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因Lef1、Tcf1、CD 44 和Cyclin D1 mRNA水平。與PBS對照組相比，*P<0.05，***P<0.001，bar=50 μm。圖4 LPS 抑制BMX后經典的Wnt/β-catenin信號Fig.4 LPS inhibits canonical Wnt/β-catenin signaling after BMX

3 討論

慢性炎癥性疾病如化膿性關節炎、骨髓炎和骨科內固定物感染中的過度骨吸收和骨破壞部分是由細菌感染誘導的炎癥反應引起[13]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種可以誘導炎癥的糖脂質成分，已被證實是革蘭氏陰性菌誘導骨破壞的介質[14]。一般情況下，LPS及LPS誘導的細胞因子可直接增強破骨細胞功能，增加骨吸收。然而，LPS對成骨細胞功能的影響以及在骨形成中的作用存在爭議[5]。本研究中，我們采用BMX模型，研究LPS對骨形成的作用。我們發現LPS可以在體內抑制間充質細胞增殖，抑制成骨分化，導致BMX后早期骨形成減少。進一步機制研究發現，LPS抑制了BMX后經典的Wnt/β-catenin信號通路。

骨髓炎的特征性病理表現是骨重建失衡和骨量丟失，但同時也存在著過度的新骨形成[14]。有研究發現細菌感染引起的炎癥反應通常會導致骨溶解和骨愈合受損，但矛盾的是，它也有促進骨形成的作用[15]。在人類內毒素血癥患者中血清骨形成生物標志物I型前膠原N末端前肽水平升高[8]。Xing等[9]在體外研究中發現，LPS可以促進人牙周膜干細胞的成骨分化。而Nogueira等[16]研究發現LPS處理不影響大鼠脛骨鉆孔模型中的骨形成和骨愈合過程。在體外實驗中，低濃度LPS可以促進人BMSCs增殖和成骨分化，而高濃度LPS則抑制其增殖和成骨分化[17]。在成骨前體細胞(MC3T3-E1)中，LPS通過JNK通路誘導其凋亡，抑制其成骨分化[18]。LPS可以抑制BMP-2誘導的BMSCs成骨分化[19]。在體內實驗中，Yang等[5]研究發現，LPS可以時間依賴性的抑制小鼠骨形成。腹腔內或局部注射LPS都會導致骨形成減少，導致骨愈合延遲[6-7]。造成上述結果不一致的可能原因與各研究中使用的材料和研究手段等不同有關。BMX是目前比較公認的可以在短時間內研究骨形成和骨重塑相關過程的模型。我們的研究發現LPS可以抑制BMX后早期的成骨分化和骨形成。

Wnt/β-catenin信號通路在成骨分化和骨形成中發揮著重要的作用[20]。近期有研究報道LPS與Wnt/β-catenin信號通路相互串話進而調節成骨細胞功能。Guo等[18]研究發現，LPS處理前成骨細胞系后，可以降低Wnt3a和β-catenin蛋白水平，升高GSK3β蛋白水平，進而抑制其成骨分化。而Xing等[9]研究發現，LPS可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進人牙周膜干細胞的成骨分化。在本研究中我們發現，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中β-catenin陽性細胞較對照小鼠降低，Wnt/β-catenin信號通路下游相關靶基因表達降低。我們的結果提示LPS可能通過負向調節Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制成骨分化，引起BMX后早期骨形成減少。

本研究中，我們僅探討了LPS對BMX后早期(BMX后1周)骨形成的影響，LPS對BMX后晚期(BMX后2周和3周)骨形成的影響需進一步研究。同時，既往研究[17]報道，體外實驗中LPS對BMSC的成骨分化和增殖影響具有劑量依賴性，LPS在體內對BMX后骨形成的影響是否具有劑量依賴性，需要進一步研究。本研究結果僅基于單個劑量和單個時間點，對相關機制的研究還不夠深入，后續我們將采用不同劑量的LPS處理小鼠，觀察不同劑量LPS對BMX后骨形成的影響。

綜上所述，我們的研究結果顯示，LPS處理可以抑制間充質細胞的增殖和成骨分化，導致BMX后早期骨形成減少，Wnt/β-catenin信號通路可能參與LPS抑制BMX后早期骨形成的過程。上述研究結果將深化我們對LPS及其與Wnt/β-catenin信號相互串話在骨形成中的作用，為尋找骨感染后促進骨再生的生物治療提供了實驗依據。