ATM基因多態(tài)性在肺癌易感性中的應(yīng)用研究

彭華，張式一

（1.湖南交通工程學(xué)院，湖南衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽 421001）

癌是最常見的惡性腫瘤，也是許多國(guó)家人口死亡的主要原因之一。隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏加快，以及大環(huán)境的改變，肺癌的發(fā)病率和死亡率在許多國(guó)家都居高不下，如此高的死亡率，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高患者生存率的根本所在。肺癌發(fā)病的因素較多，包括外在因素、內(nèi)在遺傳因素，外在因素主要包括環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣等，有研究表明，很大一部分女性不吸煙，但也有罹患肺癌的危險(xiǎn)，那么，環(huán)境和生活方式是誘發(fā)女性發(fā)生肺癌的主要原因[1]。內(nèi)在遺傳因素，一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題，不同人群對(duì)致癌物的易感性不同，而且遺傳因素可能在癌癥病因中起重要作用，有研究表明肺癌親屬后代發(fā)病的概率會(huì)高于普通人群，有學(xué)者提出發(fā)病具有遺傳易感性[2]。ATM基因是一個(gè)位于11q23號(hào)染色體上的共濟(jì)抑制劑，編碼是一個(gè)由3056個(gè)氨基酸組成的350-KDa蛋白，對(duì)電離輻射或其他DSB誘導(dǎo)劑極為敏感，屬于PI3K樣絲氨酸的3－激酶（PI3K）蛋白/蘇氨酸蛋白激酶（PIKK）家族。目前，家族遺傳易感性被越來越多的人重視，ATM基因是導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的致病基因，與許多人類癌癥有關(guān)，然而，有學(xué)者表明，該基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生中的作用有一定的探索。Hushan Yang等[3]采用病例對(duì)照研究方法對(duì)556名高加索非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者和556對(duì)照組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)年齡，性別和吸煙情況與肺癌的發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性。本研究采用SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)檢測(cè)ATM基因rs175048、rs227060兩位點(diǎn)多態(tài)性，來探討兩位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肺癌患者吸煙、年齡、性別、腫瘤家族史等的相關(guān)性。

一、材料與方法

（一）研究對(duì)象

本研究收集2021年10月到2022年3月衡陽地區(qū)某醫(yī)院樣本，在患者知情同意下，采集肺癌患者血液120例，男76例，女44例，正常對(duì)照組為健康人群120例，男60例，女60例。收集研究對(duì)象的相關(guān)信息，如年齡、性別、吸煙史、腫瘤家族史等相關(guān)資料。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

采集外周靜脈血2ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用上海天根生物工程有限公司提供的試劑盒，提取外周血游離DNA，-20°保存。采用SNP敏感性分子開關(guān)[4]（on-off switch）技術(shù)對(duì)兩位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，rs175048A/T：正向引物1（F1）5’-TGCCTAGAAAATAAGCTA-3’，正向引物2（F2）5’TGCCTAGAAAATAAGCAA 3’，反向引物（R）5’-TCAACACTGCATTACCTC-3’；rs227060C/T正向引物1（F1）5’- AATACTCAAAAGCTTCTC -3’，正向引物2（F2）5’-AATACTCAAAAGCTTCTT -3’，反向引物（R）5’-TACTTCCATTATTTCTTG -3’。聚合酶鏈反應(yīng)體系（PCR）：采用25ul反應(yīng)體系，包括模板DNA 1.5ul、正反向引物各1ul、公共引物1ul、去離子水9ul、2*Pfu Mix 12.5ul。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，取PCR產(chǎn)物5ul，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。兩樣本間均數(shù)的比較采用T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)（χ2），多樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用非條件Logistic回歸模型對(duì)肺癌危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)即比值（OR值）及其95%置信區(qū)間（95%CI），所有顯著性檢驗(yàn)均采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

（一）病例組與對(duì)照組的一般資料分析

肺癌發(fā)生發(fā)展跟年齡、家族史、吸煙史有關(guān)，年齡（P＝0.007）、腫瘤家族史（P＝0.001）、吸煙史（P＝0.013），那么在兩組資料間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 臨床病例一般資料分析[n（%）]

（二）兩位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌危險(xiǎn)因素的關(guān)系

在rs175048位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)AA、TT、AT三種基因型，其中分布頻率最高的為AT基因型；在rs227060位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)CC、CT、TT三種基因型，其中分布頻率最高的為CT基因型。基因型頻率分布在兩組別中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表2。對(duì)肺癌危險(xiǎn)因素（性別、年齡、吸煙史、腫瘤家族史）利用非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，rs175048、rs227060多態(tài)位點(diǎn)的基因型與性別在病例組與對(duì)照組間無明顯差異（P＞0.05），表明性別可能不影響兩位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；而年齡、吸煙史、腫瘤家族史在兩組間的差異則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明年齡和腫瘤家族史等可能影響rs175048、rs227060位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。見表3。

表2 兩位點(diǎn)基因型分布情況[n（%）]

表3 ATM基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺癌相關(guān)危險(xiǎn)因素分析

三、討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展跟環(huán)境因素和遺傳因素密不可分，患者的主要表現(xiàn)為聲音嘶啞、持續(xù)發(fā)熱、胸悶、咳嗽等，聲音嘶啞是肺癌患者早期的表現(xiàn)[5]。根據(jù)病情進(jìn)展，肺癌的發(fā)病機(jī)制并未十分明確，但是眾所周知，長(zhǎng)期接觸有毒有害氣體，也是最重要的危險(xiǎn)因素。那么根據(jù)誘因不同，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，一直是腫瘤治療有力的依據(jù)。所以易感基因?qū)Ψ伟┑脑缙谠\斷篩查，是十分有必要的。ATM基因rs175048、rs227060兩位點(diǎn)多態(tài)性在多種腫瘤中都存在，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、兒童白血病等疾病。對(duì)于中國(guó)人來說，肺癌的發(fā)病率每年都在增加，那么找到肺癌的發(fā)病機(jī)制，是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問題。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)肺癌占腫瘤發(fā)病率的40%，女性的發(fā)病率較高，尤其是從未吸煙的女性，那么食用油煙、燃料煙、被動(dòng)吸煙和職業(yè)暴露被認(rèn)為是中國(guó)女性中可能的危險(xiǎn)因素，主要是基于中國(guó)人的傳統(tǒng)飲食習(xí)慣、生活方式和社會(huì)環(huán)境[6]。毫無疑問，環(huán)境和遺傳因素是重要的影響因素。本研究對(duì)120例病例樣本的腫瘤家族史、吸煙史、年齡等相關(guān)因素進(jìn)行分析，運(yùn)用非條件 Logistic 回歸分析rs175048、rs227060兩位點(diǎn)多態(tài)性相關(guān)的肺癌危險(xiǎn)因素，結(jié)果表明，rs175048、rs227060位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)受吸煙史的影響，這與Zhang L在肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究結(jié)果一致[7]。本研究選擇ATM基因作為研究對(duì)象，ATM蛋白的異常已被認(rèn)為與許多癌癥的病因有關(guān)。ATM蛋白作為一種多功能蛋白激酶，可通過自磷酸化調(diào)控細(xì)胞周期，在DNA損傷、修復(fù)以及編排中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究進(jìn)一步分析ATM基因rs175048、rs227060兩位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組基因型分布特點(diǎn)，結(jié)果通過SNP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rs175048檢測(cè)出AA、AT、AT三種基因型，頻率分別為20.8%、47.5%、31.7%，其中AT分布頻率較高；rs227060檢測(cè)出CC、CT、TT三種基因型，頻率分別為36.7%、51.7%、11.6%，其中CT分布頻率較高，病例組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有研究顯示，漢族人群肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與ATM基因多態(tài)性相關(guān)。而本次研究發(fā)現(xiàn)，ATM基因rs175048、rs227060位點(diǎn)的TT基因型存在相關(guān)性，攜帶AT、CC基因型的個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)比較低，這提示肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與ATM基因多態(tài)性兩位點(diǎn)遺傳因素可能存在相關(guān)性。

綜上所述，ATM基因rs175048、rs227060兩位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肺癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性，但本研究可能存在一些局限性，主要病例樣本數(shù)少，其遺傳背景單一，導(dǎo)致研究結(jié)果可能具有部分偶然性。因此，利用SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)對(duì)肺癌易感基因的篩查，為臨床腫瘤早期診斷、早期篩查，提供了良好的醫(yī)學(xué)背景，并對(duì)肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定了良好的基礎(chǔ)。