一次性生物反應系統專用膜的研究進展

李曉敏，唐毓婧，賈軼靜，李長金，李 杰，郭子芳

（中國石化 北京化工研究院，北京 100013）

一次性生物反應系統是生物制藥領域生產疫苗、單克隆抗體、重組藥物蛋白等生物產品的重要設備，主要是由美國食品藥品監督管理局認證的塑料材料（聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙烯乙烯醇等）制成的一種即裝即用、不可重復利用的培養器［1］。20 世紀開始應用［2-3］。1963 年，一種由聚丙烯和聚四氟乙烯制成的一次性搖晃四面體袋成功應用在枯草芽孢桿菌等細胞的培養上［4］。隨后一次性中空纖維膜生物反應器［5-7］、細胞工廠［8-10］及兩室透析膜生物反應器［11-12］在動物細胞培養領域占據了主要地位。在此階段，也有少量研究描述了波浪混合對微生物和細胞在袋體中培養的適用性［13-14］。20 世紀末，Wave Biotech 公司成功開發出波浪混合式一次性生物反應器，并推出了第一臺用于商業化生產的WAVE Bioreactor 20 反應器，標志著一次性生物反應系統的大規模應用［15-16］。該系統應用廣泛，市場前景良好。

一次性生物反應系統專用膜是一次性生物反應器的主要部分，專用膜是一種聚合物單層或多層薄膜，在使用過程中通常一面直接與培養液體接觸，另一面與外界接觸，具有良好的氣體阻隔功能，可為細胞生長提供環境保障［2］。以目前應用較多、典型的5 層結構為例，專有膜主要分為外層、內層、中間阻隔層及兩層中間黏結層。外層通常由強度高、韌性好、耐穿刺、耐折疊的材料制成，保障內部細胞或微生物的培養。內層為液體接觸層，直接和細胞、微生物、培養基等物料接觸，需要具備較低的可提取物或浸出物，滿足細胞的正常生長和代謝，為細胞培養營造適宜的環境。阻隔層在中間，提供氣體阻隔性能，為細胞生長提供環境保障。黏結層的作用是將上述三層結構黏結在一起，保障膜體結構完整且反應液體不泄露。

本文對一次性生物反應系統專用復合膜的發展歷程、組成結構、使用原料及制造工藝進行介紹，綜述了目前主要專用膜產品及相關評價指標，并對一次性生物反應系統專用復合膜的未來發展進行了展望。

1 專用膜原料

一次性生物反應系統專用膜所用原料均為熱塑性聚合物材料，具有共同的性質，可通過加熱使其變為黏稠液體，便于后期加工成膜。單層專用膜的主聚合物通常只有一種，并輔以相應的添加劑，多層專用膜各層功能不同，對聚合物的要求也不同，因此需根據不同層的性能需求選擇合適的聚合物。聚合物的性質主要和分子量及其分布、共聚單體種類和含量有關，并決定著聚合物最終的行為方式。

1.1 內層

專用膜內層為液體接觸層，與培養液體直接接觸，材料主要具備以下功能：1）較好的柔韌性、抗撕裂性、耐穿刺性，保證在使用過程中的可靠性。2）低可提取物/浸出物，能滿足細胞的正常生長和代謝，為細胞生長營造適宜的環境，有較好的生物相容性，適于細胞培養。3）熱封性：液體接觸層需具備足夠的熱封強度，能為生物反應器袋體加工提供熱合焊接功能，避免在使用時出現液體滲漏［2］。可用作接觸層的材料類型有線型低密度聚乙烯（LLDPE）、超低密度聚乙烯（ULDPE）、低密度聚乙烯（LDPE）共聚物或混合物、乙烯-醋酸乙烯共聚物（EVA）等。LLDPE 以良好的機械性能聞名，如撕裂強度、抗穿刺性、拉伸性、強度和韌性等，且在柔韌性、密封能力和韌性之間提供了非常好的平衡，這些特性使它成為膜內層材料的良好候選材料之一。ULDPE 既具有 LLDPE 的高強度，又具有較高的熱封強度。EVA（醋酸乙烯酯含量為4%～18%（w））與 LDPE 非常相似，具有高支化度，可形成硬度低、韌性高、熔體溫度低、柔韌性高和透明度高的低結晶材料，可作為內層接觸材料使用。

1.2 阻隔層

阻隔層用原料通常為乙烯乙烯醇共聚物（EVOH）。使用EVOH 的主要原因是EVOH 可以提供氣體阻隔性［17］。EVOH 材料中乙烯的含量（24%～48%（x））越低，阻隔性能越高。且EVOH 對濕度敏感，吸收水分會降低阻隔性能，因此EVOH 應作為中間層嵌入提供防潮功能的兩層中。另外，聚酰胺（PA）也稱尼龍，具有較高的柔韌性和略遜于EVOH 的氣體阻隔性能，由于EVOH 耐水性和耐彎折性較差，因此國內也有一些研究者提出EVOH 和尼龍的兩層或三層復合結構作為阻隔層使用［18-19］。聚偏二氯乙烯具有非常好的水蒸氣阻隔性能，也有望替代 EVOH用作阻隔層。

1.3 外層

專用膜外層用原料通常為聚乙烯系列、EVA、PA、聚酯等聚合物材料，與內層較為相似。外層材料具有的主要性能是焊接操作的熱穩定性和良好的機械性能（高強度、柔韌性、抗穿刺等）。因為一次性生物反應系統的容積決定了生產效率，大型反應器需要配備大容積工藝袋，專用膜材料需要具備足夠的強度，焊接結構需要足夠的可靠性，需要經受較大的使用壓力及工藝袋在制作、折疊包裝、運輸、展開安裝和正常使用過程中可能產生的各種彎折和可能的損傷。聚乙烯系列和EVA 的性質能夠符合外層的需求。PA 能夠用于專用膜的主要原因是穩定性和優異的機械性能，如拉伸強度、抗穿刺性。另外，聚酯類，聚對苯二甲酸乙二醇酯由于優異的耐熱性和機械性能，也常用于專用膜外層。

1.4 黏結層

黏結層的主要特性是將阻隔層連接到內外層，因此需采用具有黏結作用的聚合物原料，通常可用作黏結層的材料類型為酸酐改性聚烯烴或酸改性聚烯烴，如馬來酸酐接枝的乙烯/丁烯（己烯、辛烯）共聚物。

2 膜制造過程

從原料到多層復合膜材料需要一定的制造工藝來實現，通常為薄膜擠出工藝［20-21］。在多層聚合物原料復合過程中，除原料外，各層添加物和膜的厚度也需要重點關注。在制造過程中添加一種或多種添加劑，主要是為了使薄膜更好地復合在一起，或者不易氧化、膠黏等。同時，總體膜的厚度及各層的厚度也有一定的要求，需滿足各層膜和整體的性能指標。

2.1 專用膜生產工藝

在專用膜的工業化生產中，吹塑、流延、擠出層壓等薄膜擠出工藝是最常用的工藝技術［2］。基本過程是將經選料得到的各層原料組分分別加入到多層共擠吹膜機（流延機等）對應的進料通道中，在特定機頭溫度條件下，經熔融、吹塑或流延共擠出、擠出再涂布等，通過調整相應工藝參數得到特定厚度的多層共擠出一次性生物反應系統專用膜。多層共擠出吹塑是多層聚合物復合膜材料的一種成型方法，它可以將兩種以上的聚合物，使用兩臺以上的擠出機，分別熔融后經過各自獨立的流道，進入多層口模共同擠出具有多層結構的“膜管”，并成型為多層結構的聚合物復合膜材料。通過流延方法制備的聚合物薄膜，是先經過擠出機把原料塑化熔融，再通過T 形結構成型模具擠出，聚合物熔體呈片狀流延至平穩旋轉的冷卻輥筒表面上，膜片在冷卻輥筒上經冷卻降溫定型，再經牽引、切邊后收卷。擠出涂布是先擠出兩層或多層膜，然后在表面涂布一層聚合物。應根據多層膜結構設計、原料等選擇合適的工藝進行膜的制備。值得注意的是，完整的吹膜、流延膜或涂布過程一般都在潔凈室中進行，以保證不受外部污染。

另外，在膜制造過程中，各層結構中通常需添加一種或多種添加劑。如添加抗氧化劑三（2，4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧劑168）、3-（3，5-二叔丁基-4-羥苯基）丙酸十八烷酯（抗氧劑1076）、四［β-（3，5-二叔丁基-4-羥基苯基）丙酸］季戊四醇酯（抗氧劑1010）、丁基羥基甲苯等。又如在外層添加防黏結的二氧化硅、硅酸鎂、碳酸鈣、硬脂酸鈣、硅氧烷等。但一般內層需與細胞介質接觸，接觸層則不應包含滑爽劑或鄰苯二甲酸酯為增塑劑，因為這些添加劑可能包括能夠遷移至內層表面的小分子物質，進而污染細胞。

2.2 專用膜厚度

一次性生物反應系統專用膜的總厚度和每一層的厚度，都需要認真選定。每層的厚度選擇決定著專用膜的強度、韌性、氣體阻隔性、穩定性等。專用膜總厚度一般在200 ～500 μm，目前市場上的專用膜產品通常為350 μm 左右。其中，作為與細胞接觸的液體接觸層和最外層的防護層相對較厚，以保證膜材的強度、韌性、熱合強度，通常外層厚度在50 ～150 μm，內層厚度在150 ～300 μm；阻隔層厚度達到相應的氣體透過率要求即可，厚度適中，通常在15 ～50 μm。黏合層需提供黏合作用，通常厚度為5 ～50 μm。

3 專用膜產品及主要性能指標

3.1 國內外專用膜產品

專用膜材料一般是直接制成一次性生物反應袋、攪拌袋、儲液袋等出售，單獨出售膜產品的較少。目前，膜產品主要由國外幾家公司生產并制成相應的下游產品出售。主要有德國雷諾麗特公司、賽多利斯公司、美國賽默飛世爾科技公司、密理博公司、通用公司及頗爾公司。目前，膜產品多為5 層結構，內層使用聚乙烯系列產品居多，尤其是ULDPE，阻隔層幾乎全部采用EVOH，外層的選擇比較多樣，聚乙烯系列、聚酯系列都是常見的選擇，見表1。

表1 國外主要一次性生物反應系統專用膜產品及組成結構Table 1 Main foreign film products and structures for disposable bioprocessing systems

國內能夠進行膜制品及袋體生產的公司較少，且原料和膜材料主要依賴進口。2022 年初，上海樂純生物技術有限公司推出了LeKrius 生物工藝薄膜（ULDPE/tie/EVOH/tie/LDPE），并實現了量產，有望緩解一次性生物反應系統原材料緊張、成本高昂等問題。浙江金儀盛世生物工程有限公司、上海東富龍科技股份有限公司、楚天科技股份有限公司等也對膜材料，配液袋、儲液袋等袋體，一次性生物反應器等開展了相關工作［18-19，22-23］。

3.2 專用膜性能評價

多層結構專用膜的性能評價主要包括四個方面：機械性能、物理性能、穩定性及生物安全性。由于專用膜的特殊使用環境，需要膜材料具備優異的強度、柔韌性、耐刮擦、耐穿刺、熱封性等機械性能。同時，在長時間細胞培養和運輸過程中，需嚴格控制膜材內外部的氣體交換、監測膜內液體情況，因此，膜的氣體阻隔性和透明性也是必須考察的重要因素。另外，膜的穩定性和生物安全性是工業化應用的必要前提。只有綜合考慮這些性能，才使膜更具有實用性。

3.2.1 機械性能

機械性能（強度和韌性、熱封性、耐穿刺性、抗疲勞性等）是專用膜重要的技術指標，是膜材料能夠用于一次性生物反應系統的重要前提。專用膜強度和韌性是最先考察的一個要素，通常通過拉伸強度及伸長率、斷裂強度和伸長率、彈性模量等測試來判斷，同時，膜材料制備為袋體時，需進行熱封，因此一定的熱合強度也是材料的必備性能。為使袋體內部液體不易泄漏，材料必須是耐穿刺的。并且制成的袋體可能用于攪拌系統，長時間的攪拌對材料的性能要求較高，除了強度和韌性外，抗疲勞性也是材料應用的前提。

3.2.2 物理性能

一次性生物反應袋、儲液袋等需嚴格控制袋體內部和外部的氣體交換，尤其是氧氣、水蒸氣和二氧化碳，因此專用膜需具備良好的氣體阻隔性能。專用膜的氧氣透過量一般必須小于9.9 mL/（m2·d·MPa）。同理，一般二氧化碳和水蒸氣的透過量也需處于較低水平，才被認為具有良好的阻隔性能。此外，透明性也是專用膜的一個重要考察指標。膜材需具有良好的透明性（透光率大于等于75%），才有利于操作人員觀察袋體內部情況，以便對反應進程、液體存儲情況進行監測。

3.2.3 穩定性

專用膜存在與袋體內部溶液相互作用的潛在風險，因此膜自身穩定性是質量保障的前提。穩定性主要包括熱穩定性、耐酸堿能力，凍存/解凍穩定性以及輻照穩定性。以輻照穩定性為例，γ 射線輻照可能增加聚合物內部的交聯或添加劑的降解［24］，而專用膜在使用前均需通過γ 射線輻照進行無菌處理。因此考察輻照后專用膜是否發生變化是判斷材料輻照穩定性的重要方式。

從專用膜的制備過程可知，專用膜并非純化合物。除了基礎聚合物，中間可能還需加入抗氧化劑、抗黏結劑等改善聚合物的加工性能或增強最終的使用性能。因此，專用膜上還可能存在一些不良殘留物，比如未反應的單體、過程中使用的溶劑、聚合催化劑、表面活性劑或聚合物降解產物，可能對細胞產生毒性作用，影響材料的生物相容性。據報道膜材料中常見的溶出物抗氧化劑分解產物雙（2，4-二叔丁基苯基）磷酸酯僅百萬分之幾的含量就會對細胞生長產生有害影響［25-28］。對膜供應商而言，可提取物和可浸出物的測定是工藝驗證的重要部分，是必須提供的產品參數。目前，除《美國藥典》中有制藥包裝/運輸體系相關可提取物測試方法外，也有部分針對一次性系統中可提取物和溶出物測試方法的研究［29-32］。

3.2.4 生物安全性

專用膜主要用于抗體、重組蛋白等生產過程，產品與人民的生命健康息息相關，因此必須保障專用膜的生物安全性。專用膜的生物安全性主要分為體外生物安全性和體內生物安全性，體外生物安全性驗證最常用的是體外細胞毒性實驗，測試方法參考《美國藥典》中的方法。另外，溶血實驗和細菌內毒素檢查法也常用來判斷專用膜與血液的相互作用以及細菌內毒素是否符合規定。體內的生物安全性主要是參考塑料的體內生物反應性，通過全身注射實驗、皮下注射實驗以及植入實驗檢測動物對專有膜的生物反應性，測試方法參考《美國藥典》中的方法。一般國外制造商生產的專用膜產品均為最為嚴格的Ⅳ級，因此這類專用膜產品被認為具備良好的生物相容性。當然，也可采用標準GB/T 16886.5―2017［33］，GB/T 16886.6―2015［34］，GB/T 16886.10―2017［35］，GB/T 16886.11―2011［36］對 一次性生物反應專用膜、反應袋或儲液袋等制品的生物安全性進行相關評價。

4 結語

隨著一次性生物反應系統規模的擴大，袋體容量也在擴大，商業化應用最大規模一般為2 000 L，如何平衡袋體容量規模和專用膜性能之間的關系，使其能夠更好地用于一次性生物反應系統，是后續主要的研發方向。專用膜溶出物和析出物帶來的問題不可忽視，對聚合物也有一定的要求，尋求安全性和穩定性更高的聚合物進行專用膜復合是后續需要解決的重要問題。一次性生物反應系統除了用于抗體和重組蛋白的生產外，也逐步擴展到微生物發酵、藻類培養、食品和化妝品生產等，需設計更符合實際應用場景需求的專用膜結構。