多靶點沉默SOST基因修飾MC3T3-E1細胞注射對小鼠椎體微結構的影響

蘇 軍，趙明興，李 芳，林乃鍇，孫長英，魯世金

1.杭州市余杭區第一人民醫院骨科，杭州 310000

2.長治醫學院附屬和平醫院骨科，長治 046000

3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院中西醫結合轉化醫學中心，南寧 530000

原發性骨質疏松癥與年齡增長及婦女絕經有關，其特征是骨量減少，骨組織顯微結構改變（松質骨骨小梁變細、斷裂、數量減少，皮質骨多孔、變薄）以致骨脆性增高，易發生骨折［1-3］。原發性骨質疏松癥的發生機制是骨形成和骨吸收動態平衡失調，骨吸收過度而新骨生成不足［4-5］。目前，臨床上應用的抗骨質疏松藥物主要分為骨吸收抑制劑和骨形成促進劑，雖然有一定的治療作用，但是由于耦合效應，骨吸收抑制劑可引起骨形成減少，同樣，骨形成促進劑也可引起骨吸收增加，從而限制了它們的功效［6］。深入了解成骨和破骨的分子機制有助于開發新的靶向治療藥物，如骨硬化蛋白（SOST）抑制劑和轉化生長因子抑制劑等［7］。

1 材料與方法

1.1 SOST基因沉默質粒構建

首先經PubMed BLAST檢索小鼠SOST基因序列，設計2條小鼠共打靶SOST基因沉默靶序列和1條陰性對照序列，根據所選用載體結構設計并合成61 ～ 63 nt的單核苷酸鏈，退火形成雙鏈shRNA（表1）。將磷酸化/退火反應體系放入熱循環儀上，37℃30 min，95℃ 5 min，然后以5℃ /min的速度快速降至25℃，單鏈oligos退火為雙鏈oligos，測序結果顯示目的雙核苷酸鏈已經插入，證明SOST基因沉默載體構建成功（圖1）。將SOST基因沉默載體，陰性對照載體轉染至小鼠骨細胞進行培養，并設置空白對照組（不轉染任何載體），待細胞達到對數生長期時，裂解各組細胞，提取總蛋白，應用Western bloting檢測各組sclerostin蛋白（SOST基因編碼的蛋白）的表達差異，篩選出SOST基因沉默效果最好的載體。

表1 SOST基因沉默靶序列Tab.1 SOST gene silencing target sequence

圖1 SOST基因沉默雙核苷酸鏈靶序列插入PLX-shRNA-1質粒后的測序Fig.1 Sequencing of SOST gene silencing dinucleotide chain target sequence after insertion into PLX-shRNA-1 plasmid

1.2 模型制作

將驗證并篩選的效果最好的慢病毒SOST-RNAi載體、SOST-N陰性對照載體分別與包裝載體系統一起轉染293T細胞，包裝為假病毒顆粒采用3種方式處理小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1：①多靶點SOST基因沉默技術修飾并同時轉染CRISPR-sgRNA載體系統和SOST-RNAi修復模板載體假病毒顆粒；②同時轉染CRISPR-sgRNA載體系統和SOST-N修復模板載體假病毒顆粒；③不作任何處理。所有細胞均在相同條件下進行培養。

取18只18月齡雌性C57BL/6小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），麻醉后在無菌條件下手術切除雙側卵巢制作骨質疏松模型。模型制備成功后5周，分為3組（n=6）：SOST基因沉默組注射采用多靶點SOST基因沉默技術修飾并同時轉染CRISPR-sgRNA載體系統和SOST-RNAi修復模板載體假病毒顆粒的MC3T3-E1細胞；陰性組注射同時轉染CRISPR-sgRNA載體系統和SOST-N修復模板載體假病毒顆粒的MC3T3-E1細胞；空白組注射不作任何處理的MC3T3-E1細胞。注射量均為200 μL（含2×109個細胞），每周注射1次，共注射4次。

1.3 小鼠椎體組織切片制作和染色觀察

各組小鼠在相同條件下繼續喂養2個月后手術取出L1～3，將附著的肌肉組織剔除，用無菌蒸餾水反復沖洗。盡快對樣品進行相應檢測，暫不檢測的樣品保存于-80℃冰箱中。椎體組織用4%多聚甲酫溶液固定，經過脫鈣、無水乙醇脫水、二甲苯中透明后石蠟包埋。將石蠟塊先按組織的形狀切割，然后進行切片、貼片。

1.3.1 HE染色

取石蠟切片，脫蠟后放入雙蒸水中漂洗10 min；用Mayer 蘇木精溶液染色10 ～ 15 min ；雙蒸水浸洗5 min；在0.5%鹽酸-乙醇溶液中分色1 min；自來水浸洗20 min以上；雙蒸水漂洗5 min；0.5%伊紅染色1 ～ 2 min ；95%乙醇脫水3 min，重復2次 ；100%乙醇脫水3 min，重復2次 ；二甲苯透明 5 min，重復3次；中性樹膠封片。切片于37℃烘箱干燥，在顯微鏡下觀察，分析結果，采用Image J軟件計算骨小梁面積。

1.3.2 Masson三色染色

取石蠟切片，脫蠟后放入雙蒸水中漂洗10 min；放入57℃烘箱中30 min，冷卻20 min，二甲苯透明，梯度乙醇脫水；放入飽和苦味酸溶液1 h，自來水沖洗5 ～ 10 min ；放入3% Weigert蘇木精溶液染色20 min，自來水沖洗20 min ；放入1%麗春紅-酸性品紅染色5 min，雙蒸水漂洗30 s，重復2次 ；2%磷鎢酸浸泡2 min；0.5%苯胺藍水溶液浸泡8 min；1%醋酸浸泡1 min，重復2次；雙蒸水漂洗30 s，重復2次；放入100%乙醇中浸泡2 min，重復2次；二甲苯溶液浸泡2 min，重復3次。中性樹膠封片，37℃恒溫干燥，保存，在顯微鏡下觀察并分析結果，采用Image J軟件計算骨小梁面積。

1.3.3 免疫組織化學染色

取石蠟切片，脫蠟后放入PBS緩沖液中，經抗原修復液（Vector公司，美國）80℃加熱20 min，緩沖液清洗2次，再入0.3%過氧過氫溶液內室溫作用20 min，以消除內源性過氧化物酶。在2%小牛血清（Jackson公司，美國）溶液中孵育1 h，分別加兔抗小鼠OPG抗體和RANKL抗體（1∶100，ScienCell公司，美國）4℃孵育過夜。次日經緩沖液洗滌3次后，加相應山羊抗兔IgG二抗（1∶400，ScienCell，美國）溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結合（ABC）試劑盒配制的混合液中孵育1 h。采用DAB顯色試劑盒進行顯色。呈色反應后，切片經逐級脫水并封片，顯微鏡下觀察，采用Image J軟件定量分析骨組織中OPG和RANKL表達的變化。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測SOST和骨代謝相關細胞因子的表達

用TRIzol Reagent裂解液提取小鼠L3總RNA，反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞SOST和相關細胞因子的表達水平。PCR引物序列：SOST上游引物序列為5’- CGTGCCTCATCTGCCTACTT-3’，下游引 物 序 列 為 5’- ACATCTTTGGCGTCATAGGG-3’，擴增片段長度為199 bp；RUNX2上游引物序列為 5’-AACAACAGCAACAGCAACAA-3’，下 游 引物 序 列 為 5’-CGGTAACCACAGTCCCATCT-3’，擴增片段長度為300 bp；β-catenin上游引物序列為5’-CACTGGCAGCAGCAGTCTTA-3’，下游引物序列為5’-CCCTCATCTAGCGTCTCAGG-3’，擴增片段長度為248 bp ；RANKL上游引物序列為5’-AGCCGAGACTACGGCAAG TA-3’，下游引物序列為 5’-AGTACAGGAACAGAGCGATGC-3’，擴增片段長度為167 bp；骨保護素（OPG）上游引物序列為5’-GTTCCTGCACAGCTTCACAA-3’，下游引物序列為5’-AAACAGCCCAGTGACCATTC-3’，擴增片段長度為121 bp；內參GAPDH上游引物序列為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物序列為 5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，擴增片段長度為123 bp。用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.4 統計學處理

使用SPASS 20.0軟件分析、處理數據。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用Dunnettt檢驗、方差不齊時用Dunnett T3檢驗進行兩兩比較 ；以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE 染色

SOST基因沉默組L1椎板下骨小梁面積（345 780.0±68 138.31）nm2明顯高于陰性組（229 251.0±29 336.83）nm2和空白組（220 809.67±36 865.03）nm2，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖2）；陰性組與空白組骨小梁面積差異無統計學意義（P＞ 0.05，圖2）。

圖2 L1 HE染色（×10）Fig.2 HE staining of L1（×10）

2.2 Masson三色染色

SOST基因沉默組L2椎板下骨小梁面積（383 554.67±28 059.27）nm2明 顯 高 于 陰 性 組（240 354.0±26 178.69）nm2和空白組（251 062.0±18 607.67）nm2，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖3）；陰性組與空白組骨小梁面積差異無統計學意義（P＞ 0.05，圖3）。

圖3 L2 Masson三色染色（×10）Fig.3 Masson trichrome staining of L2（×10）

2.3 免疫組織化學染色

SOST基因沉默組OPG表達量（2.59±0.76）高于陰性組（0.65±0.10）和空白組（0.82±0.10），RANKL表達量（0.57±0.08）低于陰性組（1.21±0.15）和空白組（1.33±0.17），差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖4）；陰性組與空白組OPG和RANKL表達量差異均無統計學意義（P＞ 0.05，圖4）。

圖4 L2免疫組織化學染色（×10）Fig.4 Immunohistochemical staining of L2（×10）

2.4 各組細胞SOST、骨形成標志物、骨吸收標志物基因的表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，SOST基因沉默組SOST和RANKL相對表達量低于陰性組，RUNX2、β-catenin和OPG相對表達量高于陰性組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖5）。

圖5 實時熒光定量PCR檢測L3中相關因子表達Fig.5 Expression of related factors detected by real-time fluorescence quantitative PCR in L3

3 討 論

骨質疏松癥已經成為一個世界范圍的健康問題。骨質疏松癥的發生率在老年婦女中為50% ～60%，男性中為20% ～ 30%［10］；北京市和上海市71 ～ 80歲人群骨質疏松癥發生率分別為73.1%和67.5%［11］。該病發生率高，保健費用消耗大，世界衛生組織將其列為老年人三大疾病之一［12］。

骨骼是一種具有高度復雜性和動態變化特性的結締組織，破骨細胞重吸收和成骨細胞骨重建的平衡是維持骨穩態的關鍵［13］。RUNX2是調控骨形成的重要基因，有研究［14］證明，RUNX2基因缺失導致小鼠的成骨細胞缺乏。RUNX2上調成骨細胞相關基因，如COLIA1、ALP、BSP、BGLAP和OCN等［15］。RANK和RANKL是破骨細胞形成的關鍵因子，由成骨細胞、骨細胞和間質細胞分泌，二者結合后即可誘導破骨細胞形成［16］。OPG由成骨細胞、間質細胞、成纖維細胞等多種細胞分泌，OPG與RANKL結合后可阻止RANK/RANKL相互作用，抑制破骨細胞形成［17］。β-catenin是另一個調節骨代謝的關鍵因子，激活Wnt/β-catenin信號傳遞，促進成骨細胞增殖分化，抑制破骨細胞增殖分化，改善骨代謝［18］。由此可見，成骨細胞可分泌調控成骨細胞和破骨細胞分化和成熟的主要細胞因子，即成骨細胞的分化和活性是骨重建的關鍵。

骨代謝是一個復雜的過程，受到局部微環境和全身因素的影響，包括激素（雌激素和甲狀旁腺激素等）、細胞因子、趨化因子和生物力學刺激等［19-22］。這些因素通過多種信號通路影響成骨細胞和破骨細胞的分化和活性，而SOST參與多種信號通路的活性調節。①SOST抑制Wnt/β-catenin信號傳遞，從而抑制成骨細胞分化、增殖和活性，導致骨形成減少［6］。任艷霞等［23］對156例絕經后2型糖尿病患者血清SOST表達與骨密度相關關系的研究證實，絕經后2型患者SOST高表達可能導致骨代謝異常，引起骨密度降低，增加骨質疏松發生的風險；相反，SOST功能的缺失能夠導致人類和鼠的骨密度增高［24］。②TGF-β/BMP通路是影響骨代謝的另一個信號轉導途徑。SOST主要通過競爭性結合Ⅰ型和Ⅱ型受體來抑制TGF-β/BMP通路，從而抑制成骨細胞分化及骨形成［24］。③甲狀旁腺激素（PTH）通過cAMP/PKA信號途徑抑制SOST表達［25］，PTH也可通過肌細胞促進因子2（Mef2）來抑制SOST增強子的轉錄活性［26］。④Huang等［27］的研究證明，SOST轉錄起始位點上游10 kb區域存在3個潛在的雌激素受體反應元件（ERE）。在成骨細胞中，雌激素信號與BMP2信號傳遞相互作用以間接的方式負調控SOST表達，并且，這種調控方式涉及Wnt/雌激素受體α和β-catenin信號通路［28］。⑤SOST啟動子上游有一個140 bp的元件，含有2個E-box、C/EBP和RUNX2的結合位點，該元件是SOST基因轉錄活性所必需的［29］。因此，SOST可以影響RUNX2的表達。⑥Yang等［30］發現，SOST也是成骨轉錄因子Osterix的靶基因，Osterix的結合位點位于SOST基因上游100 ～ 260 bp區域，Osterix的C末端含有能結合到特定GC富集區的DNA結合域，促進SOST啟動子活性，從而調節SOST蛋白的表達水平。SOST是一種多肽類骨相關蛋白，是骨細胞衍生的骨形成負調節因子［31］。高特異性的表達模式和獨特的骨表型使SOST成為治療骨質疏松等代謝性骨病和進行骨折修復的一個很有吸引力的治療靶點［32］。SOST抗體是最近研究的熱點之一，包括romosozumab和blosozumab，它們可以引起骨形成標志物的迅速增加，骨吸收標志物持續下降，骨密度顯著增加［3］。

隨著基因修飾技術的進步，開發基因治療的新方法勢在必行。本研究采用多靶點基因沉默技術，大大提高了沉默SOST基因表達的效率。將多靶點沉默SOST基因修飾的MC3T3-E1細胞通過尾靜脈注射到骨質疏松模型小鼠體內2個月后，觀察到小鼠椎板下骨小梁面積明顯增加，且椎體組織中RUNX2、β-catenin、OPG基因表達增強，RANKL基因表達減弱，說明注射SOST基因沉默的MC3T3-E1細胞能使骨質疏松小鼠軟骨層下骨小梁形成增多，顯著增強成骨能力。

綜上所述，沉默SOST基因修飾干細胞治療的應用有望增強骨質疏松小鼠成骨細胞的分化和活性，達到治療骨質疏松、降低骨折風險的目的。