CT引導下經皮活檢聯合宏基因二代測序技術在脊柱感染診治中的應用

胡津銓，王 晨，顧一飛，陳華江，王新偉，陳 宇，袁 文

海軍軍醫大學長征醫院骨科，上海 200003

脊柱感染在我國并不少見，因其臨床癥狀大多不典型，影像學表現不具特異性，診斷較為困難。絕大多數脊柱感染患者需要進行藥物治療，而藥物治療的基礎是獲得明確的病原學依據。脊柱感染病灶常位于椎前，位置結構較為復雜，又常鄰近重要血管和臟器，病灶組織標本難以獲得［1-2］。且傳統實驗室檢驗手段較為單一、敏感程度不高，獲得病原學診斷仍然存在困難［3-4］。

宏基因組二代測序（mNGS）技術是一種具有巨大應用前景的微生物診斷工具，其擁有龐大的數據庫，可以根據測序的結果作出診斷提示，在細菌及真菌感染性疾病的診斷中具有較大優勢［5］。本課題組通過CT引導下經皮活檢獲得脊柱感染患者病原學組織后，采用mNGS技術獲得的病原學結果選擇藥物進行個體化治療，取得較好效果，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2019年2月—2021年2月收治脊柱感染患者32例，其中男17例、女15例，年齡為17 ～ 71（42.0±15.5）歲，病程為2 ～ 14（7.0±3.3）個月 ；病灶位于胸椎9例，胸腰椎9例，腰椎及骶椎14例。臨床體征以軸性疼痛為主，其中15例因脊柱局部不穩、后凸畸形或脊髓、神經受壓而產生神經癥狀。

1.2 穿刺方法

穿刺前詳細了解患者病史，排除手術禁忌證，包括出血性疾病史或凝血功能不全、體質衰弱難以平臥至穿刺結束者。術前與患者及其家屬談話并告知風險，使其了解手術操作的意義，減少術前緊張心理。同時與影像介入科醫師一起詳細評估患者病變位置，毗鄰的臟器、血管及神經，設計穿刺路徑。患者通常取俯臥位，先通過CT定位設計最佳的穿刺點、進針路徑、角度及深度；對患者進行皮膚消毒及局部麻醉后，在CT定位下進行經皮穿刺，確認針尖進入病灶后，抽出膿性液體送檢。如膿腫較大則選擇在膿腫低位穿刺，放置引流管進行持續引流，同時方便行病灶局部藥物化療。

1.3 病原學診斷

實驗室檢查：將穿刺獲得的標本進行細菌培養及涂片、真菌培養及涂片、結核培養及涂片，并進行藥物敏感性試驗。

mNGS技術：將穿刺獲得的標本放入無菌試劑管中，保存于4℃冰箱內，次日進行樣本處理和DNA提取。按照流程用溶壁酶進行酶破壁反應，再使用DNA提取試劑盒提取DNA。對所提取的DNA進行酶切片段化、末端修復、接頭連接及聚合酶鏈式反應（PCR），構建文庫并進行測序。將測序數據（reads）去除低質量的序列數據，獲得高質量的數據。將高質量數據與人參考基因組序列進行比對，并將比對上的數據去除。剩余數據去除低復雜度數據后，與華大基因PMDB病原數據庫（包括6 350種細菌、1 064種真菌、4 945種病毒、234種寄生蟲的基因組序列）進行比對。選擇對比細菌與真菌2個項目，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數，根據序列數的高低及其他檢測結果來判斷可能的病原體。

1.4 治療

所有患者根據病原學診斷進行規范藥物治療，15例脊柱局部不穩，后凸畸形，脊髓、神經受壓的患者穿刺術后盡快擇期進行病灶清除植骨融合內固定術，術后繼續藥物治療。所有患者在治療6個月后復查三維CT重建及實驗室檢查。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用配對樣本t檢驗；計數資料以例數和百分數（%）表示，組間比較采用配對設計χ2檢驗 ；以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

32例患者中29例經CT引導下穿刺，成功獲得標本，CT穿刺取樣成功率為90.6%。29例患者的一般資料、病原學檢測結果和診斷結果見表1。在獲得的29例標本中，mNGS技術獲得明確病原學依據27例，總體檢測陽性率為93.1%（27/29），常規實驗室培養獲得病原學依據22例，陽性率為75.9%（22/29），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。mNGS檢測時間為（1.59±0.28）d，常規實驗室培養檢測時間為（12.8±3.25）d，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

表1 患者一般資料

本組檢出的主要病原體為結核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、曲霉菌、隱球菌、布魯桿菌，只有1例沒有通過mNGS技術及實驗室檢查獲得病原學結果，采用經驗用藥方案治療。脊柱結核的藥物治療：新發肺結核或肺外結核患者的治療方案為強化期2個月異煙肼（H）、利福平（R）、吡嗪酰胺（E）、乙胺丁醇（Z）4聯用藥+鞏固期4個月異煙肼（H）和利福平（R）聯合用藥（2HRZE/4HR方案）。布魯桿菌感染的藥物治療：多西環素+利福平+第三代頭孢菌素類藥物，療程3個月。化膿性脊柱炎根據藥敏結果，選擇敏感的抗生素靜脈給藥治療2個月。真菌性脊柱炎根據藥敏結果選用敏感抗生素（伏立康唑等），治療6個月［6-8］。所有患者藥物治療2周后C反應蛋白（CRP）水平和紅細胞沉降率（ESR）均較治療前下降，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）；治療后6個月疼痛視覺模擬量表（VAS）評分［9］和Oswestry功能障礙指數（ODI）［10］均較治療前改善，差異有統計學意義（P＜ 0.05，表2）。

表2 治療前后指標N=29，±s

表2 治療前后指標N=29，±s

注 ：*與治療前比較，P ＜ 0.05。

時間CRP/（mg·L-1）ESR/（mm·h-1）VAS評分ODI（%）治療前 28.1±15.9 54.7±17.0 5.3±1.7 43.3±8.4治療后 8.9±6.5* 15.2±9.7* 3.9±1.6* 19.1±5.8*

3 討 論

在大多數情況下，脊柱感染的診斷和治療需要脊柱外科、放射科和感染科醫師進行多學科會診，其多為細菌引起，真菌感染也可能發生［3，7］。根據病原體的不同，脊柱感染可分為化膿性（細菌引起）或肉芽腫性（結核分枝桿菌和真菌引起）。影像學檢查可發現脊柱感染通常累及椎間盤，形成椎間盤炎，同時病灶也可向椎管內擴散，累及硬膜外腔及椎旁軟組織。大多數情況下，感染并不局限于一個解剖腔室，通常會擴散并涉及脊柱不同部位，并且根據病原菌不同各有特點，如脊柱結核常累及多個椎體，化膿性脊柱炎則很少累及超過2個椎體［11］；同時，脊柱結核對椎間盤破壞較輕、對椎體骨破壞較重，而化膿性脊柱炎對椎間盤破壞較重、對椎體骨破壞較輕。脊柱結核骨破壞較重，椎體內膿腫常見，更易形成椎體塌陷、破壞、死骨或鈣化，發生局部后凸畸形繼而產生神經癥狀，所以除了藥物治療外還需外科手術干預［12-13］。

除了上述影像學的特征性表現外，脊柱感染的診斷還需要結合完整的病史和實驗室檢查結果，在此過程中必須調查及確定可能的感染風險因素。初始血液檢查應包括白細胞計數和炎性標志物，如ESR和CRP。CRP是靈敏度較高的感染指標，且在75%的感染病例中可觀察到ESR升高，CRP和ESR/白細胞計數升高以及與脊柱感染（如背痛和發燒）一致的臨床癥狀提示脊柱感染可能［14］。同時，CRP也是抗生素治療效果的一個重要標志，治療成功后CRP能迅速恢復到正常水平；而 ESR在臨床癥狀改善后依然保持長時間的升高［15］。與CRP和ESR相比，白細胞計數對于脊柱感染的診斷價值較小，55%的脊柱感染患者白細胞計數正常［3，16］。因此，本研究隨訪中采用CRP和ESR來反映炎癥變化情況。在診斷的過程中，病史也是至關重要的環節，如布魯桿菌脊柱炎患者通常與牧區生活史、接觸過牛羊家畜有關，真菌性脊柱炎患者則具有眾多風險因素，可能有繼發性免疫缺陷（由人類免疫缺陷病毒引起的感染）及廣譜抗生素、糖皮質激素或免疫抑制等藥物濫用史［7，17］。

相比初始的血液及影像學檢查，病灶組織活檢的病原學依據是診斷脊柱感染的金標準。結合三維CT重建圖像的CT引導下經皮穿刺活檢是獲取病灶組織的重要途徑，有文獻［18］報道，CT引導下經皮穿刺活檢診斷脊柱感染的靈敏度高于90%。在穿刺過程中，能夠通過CT增強掃描明確前方血管及側方臟器的位置，做到精準定位，清晰顯示穿刺路徑［19］。對于骶骨前方的膿腫，可行CT引導的破骨穿刺；對于較大膿腫，可在穿刺后放置固定引流管持續引流，并可通過引流管持續給藥進行局部化療；此外，在行病灶清除減壓植骨融合術后，也可根據引流情況判斷是否清創徹底［20］。

近年來，mNGS技術不斷改進并進入臨床實踐，為復雜感染的病原學診斷提供了一種有力工具。相比于傳統實驗室檢查，mNGS技術的優勢包括較短的檢測時間和基于大數據庫的無偏差的定量或半定量分析［21］。目前已有文獻報道了mNGS技術在病原體診斷中的應用，包括呼吸系統感染［17］、中樞神經系統感染［22］、血液感染和關節感染等［23-24］以及脊柱感染［25-26］。本研究結果顯示，mNGS技術對病原體的檢測陽性率高于實驗室檢查，同時獲得結果的時間較短，大大提升了檢測效率，方便早期制訂治療方案。對于mNGS技術檢測結果的解讀要結合病史資料，雖然微生物的檢出序列數越高，致病可能性就越大，但某些胞內菌（如結核分枝桿菌、傷寒桿菌、布魯桿菌）和厚壁菌（如真菌）即使檢出序列數不高，也要考慮其為致病病原體的可能［27］，例如本組中的隱球菌、布魯桿菌和曲霉菌感染病例。

值得注意的是，本組中有1例患者mNGS技術和實驗室檢查結果都為陰性，給予抗結核藥物治療后炎性指標無明顯下降，根據影像學及病史診斷為化膿性脊柱炎，采用經驗性抗炎藥物治療后療效良好。本研究樣本量較小，所得結果可能存在偏倚，未來還需要開展多中心、大樣本的研究進行驗證。

綜合來看，mNGS技術尚有一些缺點，比如其對于細菌感染（結核分枝桿菌除外）還難以提供詳細的藥物敏感性結果，同時其價格也較為昂貴，一定程度上增加了患者的經濟負擔。相信隨著mNGS技術的進一步發展，其診斷價值會不斷提升，成本及價格會逐漸降低，更好地用于臨床診療。