硬段含二硫鍵聚氨酯復合材料的生物骨黏合性

肖 偉，劉欣暢，鄭 震，王新靈，肖海軍

（1. 上海交通大學化學化工學院, 上海 200240；2. 上海市奉賢區中心醫院骨科, 上海 201400）

骨折是指由于外部創傷或自身病理導致骨組織內損傷的現象，常見于兒童和老人。每年約有數百萬人因運動損傷、交通事故、跌倒以及癌癥等引起的成骨不全、骨質疏松或骨質退化等疾病而遭受各種骨折[1]。骨釘等金屬植入物是目前治療骨折的主流方式，但仍存在一些臨床問題，包括治療費用高、需二次手術取出、應力屏蔽、小骨碎片難以固定等[2,3]。因此，醫用骨黏合劑應運而生。理想骨膠黏劑應滿足以下要求：血液等生化條件下具備一定的黏接強度；良好的生物相容性，允許骨髓干細胞的增殖、黏附和分化；易于制備、儲存和使用等。目前市面上骨填充支架材料的產品很多，但還沒有一種骨黏合劑能夠滿足所有的臨床需要。

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥和磷酸鈣（CPC）骨水泥是目前研究較多的兩類骨黏合材料。PMMA骨水泥最早在牙科中使用，后來被廣泛應用于關節假體固定中[4]。PMMA骨水泥具有生物惰性，難以體內降解，且材料的生物相容性較差，缺乏骨傳導性，不利于骨折的恢復和愈合[5]。Zhu等[6]將礦化膠原（MC）加入PMMA骨水泥中，開發了一種生物活性復合骨水泥（MC-PMMA），改善了PMMA的生物相容性。CPC骨水泥主要成分為羥基磷灰石或透鈣磷石，與天然骨骼的成分近似，因此具備良好的生物相容性，但CPC骨水泥屬于無機材料，自身較脆，與骨骼之間僅為物理作用相互連接，相互作用力不強，在骨科手術中更適合用作填充材料[7]。

除了PMMA和CPC類骨水泥，其他材料也陸續被開發用作骨膠黏劑，如丙烯酸酯類[8]、聚醋酸乙烯酯類[9]、硫醇烯類[10]等。2010年美國有一種商品名為Kryptonite?（氪石骨水泥）的骨水泥被批準臨床使用[11]，其主要成分為蓖麻油改性，由多元醇、異氰酸酯和碳酸鈣制備的聚氨酯（PU）復合材料。臨床病例顯示，這種復合黏合材料即使經過6年的使用，與骨表面依舊結合良好，鄰近區域的非骨性組織無明顯炎癥或黏連[12]。在此基礎上，本文以二硫鍵-谷胱甘肽的還原性降解為改性手段，合成了一種含二硫鍵的脂肪族二元醇（DSU），將其以硬段形式引入聚氨酯膠黏劑體系中，探究了DSU對改性聚氨酯膠黏劑（PU-DSU）的結構和性能的影響，獲得了一種黏接性能強、生物相容性優秀的聚氨酯骨膠黏劑。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

蓖麻油：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；催化劑TOYOCAT-TF（牌號）：分析純，日本東曹株式會社；二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)、單質硫：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；Na2S·9H2O、6-溴-1-己醇：分析純，北京伊諾凱科技有限公司；羥基磷灰石(HA)：w=99%，南京埃普瑞納米材料有限公司；大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)：賽業生物科技有限公司；胎牛血清：Corning公司；DMEM細胞培養基：Gibco公司；染色劑鈣黃綠素AM(Calcein-AM): Sigma-Aldrich公司。多巴胺接枝改性蓖麻油多元醇(DACO)：自制，羥值為260 mg KOH/g，接枝率為多巴胺與蓖麻油的物質的量之比，其數值等于1。所有多元醇在使用前均需在110 ℃真空烘箱中干燥2 h除水。

1.2 測試與表征

采用布魯克公司AVANCE Ⅲ HD 500型核磁共振波譜儀對DSU進行1H-NMR表征；采用MTS公司Criterion 43型萬能電子試驗機對樣品進行壓縮性能測試；采用FEI公司Nova NanoSEM 450型場發射掃描電子顯微鏡對樣品進行微觀結構表征；采用Kruss公司DSA30型光學接觸角測量儀對樣品進行表面水接觸角測試；將市場購買的新鮮豬肋骨拋光成10 mm×10 mm×40 mm，沿中線切斷，采用聚氨酯膠黏劑黏接固定好后，黏接試樣用磷酸鹽（PBS）緩沖液浸濕的紗布包覆（或浸泡在新鮮兔血液中），分別模擬體內環境，在37 ℃固化24 h后，采用對接拉伸模式測定試樣的黏接強度；將樣品切成薄片置于0.1 mol/L、pH = 7.4的PBS溶液中，于37 ℃恒溫震蕩箱中震蕩降解，測試樣品的體外降解性能；將大鼠BMSCs細胞與支架共培養1、3、5 d后，經Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)處理，采用Tecan公司Infinite M1000 PRO型酶標儀檢測細胞培養液在 450 nm波長下的光密度（OD）值；用Calcein-AM對細胞進行染色，采用徠卡公司TCS SP8 STED共聚焦顯微鏡觀察樣品的生物相容性。

1.3 實驗步驟

1.3.1 DSU的合成[13]準確稱取12 g Na2S·9H2O晶體溶于100 mL去離子水中，加入0.8 g硫，升溫至40 ℃，攪拌至完全溶解后再加入剩余0.8 g硫，完全溶解后所得溶液即為過硫化鈉溶液。稱取18.11 g 6-溴-1-己醇溶于100 mL無水乙醇中，逐滴加入過硫化鈉溶液中，50 ℃下攪拌過夜。待反應結束后，旋蒸除去乙醇，剩余液體用30 mL乙酸乙酯分2次萃取分液，經無水硫酸鈉干燥、過濾除去固體雜質，再旋蒸除去乙酸乙酯，80 ℃真空干燥24 h，所得產物即為DSU。合成反應式見圖1。

圖1 DSU的合成Fig. 1 Synthesis of DSU

1.3.2 DACO的合成稱取100 g蓖麻油、10 g Al2O3、15 g乙酸置于三頸瓶中，轉速400 r/min下滴加70 gw=30%雙氧水，60 ℃攪拌反應10 h，反應完全后，用w=3%碳酸鈉溶液洗至中性，乙酸乙酯萃取，旋蒸得到環氧改性蓖麻油；稱取50 g環氧改性蓖麻油溶于100 mL乙醇中，加入19 g鹽酸多巴胺、100 mL DMF溶劑和3 g高氯酸鋅，用三乙胺調節使體系pH = 8，N2氛圍下80 ℃反應24 h，反應結束后，室溫下用pH = 2的鹽酸溶液洗至中性，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾去除不溶雜質，旋蒸后得到產物DACO，密封保存。

1.3.3 MDI封端預聚體的合成取10 g干燥蓖麻油加入到N2氛圍保護的三頸燒瓶中，加入15 g MDI于燒瓶中，加熱至80 ℃反應3 h，冷卻后得到―NCO封端的預聚體。采用甲苯-二正丁胺法測定聚氨酯預聚體中的剩余―NCO含量，低溫密封備用。

1.3.4 PU-DSU的制備以PU-DSU-10（其中10表示m（DSU）∶m（DACO）=10%，其余類推）為例，具體制備方式如下：將3.0 g DACO、135 μL催化劑TOYOCAT-TF、15 μL發泡劑去離子水、0.3 g DSU及0.24 g HA加入燒杯中，在室溫下以1 500 r/min攪拌5 min混合均勻。然后按―NCO與―OH官能團物質的量比為1∶1計量加入4.86 g MDI封端預聚體中，1 000 r/min下攪拌30 s，混合均勻后轉移至模具中，37 ℃固化24 h。

2 結果與討論

2.1 DSU的1H-NMR表征

DSU和6-溴-1-己醇的1H-NMR譜圖如圖2所示。3.41和1.85處的核磁峰對應著Br取代α和β位上的亞甲基基團；當Br被二硫鍵取代后，由于取代基電負性的降低，α和β位上亞甲基的化學位移會降低至2.68和1.67。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 3.61～3.65 (t,J=7.0 Hz, 2 H), 2.66～2.71 (t,J=7.5 Hz, 2 H), 1.95 (m, 1 H),1.65～1.71 (m, 2 H), 1.55～1.60 (m, 2 H), 1.36～1.44 (m, 4 H)。

圖2 6-溴-1-己醇（a）和DSU（b）的1H-NMR譜圖Fig. 2 1H-NMR spectra of 6-bromo-1-hexanol (a) and DSU (b)

2.2 PU-DSU的力學性能

PU-DSU形變50%時的壓縮性能如圖3所示。當DSU的用量（m（DSU）∶m（DACO），下文同）在0～20%時，隨著DSU用量的增加，材料的壓縮性能呈增強趨勢，壓縮強度從5.9 MPa增大至8.5 MPa，壓縮模量從29.7 MPa增大至59.2 MPa。當DSU用量為10%時，材料的壓縮強度為7.0 MPa，壓縮模量為41.3 MP。這是由于DSU為短鏈脂肪族二元醇，羥值和線性結構規整度高，DSU的添加使聚氨酯中硬段結晶度增加，內聚能增加，材料的抗壓縮性能增強，壓縮強度和壓縮模量均得以提升。

圖3 PU-DSU的（a）壓縮強度和（b）壓縮模量Fig. 3 (a) Compressive strength and (b) compressive modulus of PU-DSU

2.3 PU-DSU的微觀結構

樣品的SEM微觀形貌如圖4所示。PU與PU-DSU的微孔結構、表觀密度和平均泡孔尺寸相差不大，表觀密度維持為450～475 kg/m3，平均泡孔尺寸在150 μm左右。這種多孔結構有利于細胞生長和遷移，為骨組織的愈合提供了條件[14]。

2.4 PU-DSU的水接觸角

由于DSU為短鏈脂肪族二醇，結構更規整，DSU的添加會促進氨基甲酸酯等極性基團聚集，造成聚氨酯的微相分離程度加深，所以蓖麻油長鏈疏水結構對材料表面的影響加深。PU-DSU的水接觸角如圖5所示。隨著DSU用量的增加，PU-DSU靜態水接觸角呈增大趨勢：當不添加DSU時，其接觸角為64°；而當DSU的用量為15%時，水接觸角增大至80°；當DSU用量為20%時，接觸角僅增大至81°。隨著DSU用量的增加，PU-DSU的疏水性增強，增幅具有先大后小的特點，說明此時PU-DSU的海-島分離結構已趨于穩定。

圖5 PU-DSU膠黏劑的水接觸角Fig. 5 Water contact angle of PU-DSU

2.5 PU-DSU的黏接性能

PU-DSU的黏接強度測試結果如圖6所示。在PBS緩沖液體系中，隨著DSU用量的增加，膠黏劑的骨組織黏接能力呈現先上升后下降的趨勢。當DSU用量為10%時，膠黏劑的骨黏接強度最高可達0.97 MPa；而當DSU用量增至20%時，黏接強度又回跌至0.57 MPa。這是因為與蓖麻油相比，DSU的羥值較高、結構更規整，少量添加會使膠黏劑中起黏接效果的硬段比例增加，黏接性能提升；但骨組織是由磷酸鈣鹽和蛋白質等組成的有機-無機雜化體系，表面呈親水性，隨著DSU用量的進一步增加，膠黏劑的疏水性增強，表面浸潤性變差，黏接強度繼而發生下降，故DSU的最佳用量為10%。在新鮮兔血液中的黏接實驗同樣證實了該結論，由于血液中血紅蛋白等生化物質的影響，膠黏劑的黏接強度降低，當DSU的用量為10%時，最大黏接強度為0.49 MPa。據報道，市面上常見的CPC類和PMMA類商品化骨水泥，在水和血液中的最大黏接強度均不超過0.2 MPa[15]。本文所制備的PU-DSU膠黏劑在生物骨黏合方面優勢明顯。

圖6 PU-DSU膠黏劑的骨黏接強度Fig. 6 Bone bonding strength of PU-DSU

2.6 PU-DSU的體外降解性能

PU-DSU-10在不同谷胱甘肽（GSH）質量濃度下的降解情況如圖7所示。樣品在pH=7.4的PBS緩沖液中水解速率較慢，14周后僅降解0.79%。隨著GSH質量濃度的增大，樣品的降解速率明顯增大，14周后的質量損失率增大至1.24%，降解速率提升57%。

圖7 PU-DSU-10在GSH溶液中的降解曲線Fig. 7 Degradation of PU-DSU-10 in GSH solutions

2.7 PU-DSU的生物相容性

PU-DSU-10的生物相容性測試結果見圖8。圖8 （a）為不同培養時長下BMSCs的細胞活性。在第3 d時，PU-DSU-10樣品中的BMSCs細胞數量大幅增加，這可能是因為樣品的多孔結構為BMSCs細胞提供了更多的黏附空間，有利于其增殖，但培養基中營養物質有限，一段時間后細胞數量達到均衡。圖8 （b）和圖8 （c）則顯示了BMSCs細胞在樣品表面的黏附情況，可以清晰觀察到活細胞在樣品表面的增殖和黏附，PU-DSU-10具有優良的細胞相容性。

圖8 PU-DSU-10的（a）細胞活性，培養（b） 3 d后和（c） 5 d后的細胞形態Fig. 8 (a) Cell activity, cell morphology after (b) 3 d and (c) 5 d culture of PU-DSU-10

3 結 論

（1）采用鹵代烴的親核取代反應，成功合成了一種含二硫鍵的脂肪族二元醇DSU并將其以硬段形式引入聚氨酯體系中。

（2）當DSU用量為10%時，PU-DSU膠黏劑的綜合性能較佳，骨組織黏接強度為0.97 MPa，血液等生化條件下黏接強度為0.49 MPa，壓縮強度為7.0 MPa，壓縮模量為41.3 MPa，在GSH溶液中降解速率提升57%。

（3）PU-DSU骨膠黏劑具有良好的細胞相容性，其多孔結構有利于細胞的增殖和黏附。