子宮內膜息肉與胰島素抵抗及PI3K、Akt蛋白表達的關系

李雪琳，王菲凡，彭丹紅

(1.東南大學附屬中大醫院江北院區 婦產科，江蘇 南京 210044； 2.東南大學醫學院，江蘇 南京 210009； 3.東南大學附屬中大醫院 婦產科，江蘇 南京 210009)

子宮內膜息肉(endometrial polyp，EP)是子宮內膜局部過度增生所形成的突向宮腔的贅生物，常引起異常子宮出血及不孕，可發生惡變[1]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)通過誘導高胰島素血癥激活胰島素下游信號轉導通路磷脂酰肌醇- 3磷酸激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)[2- 3]，進而導致內膜細胞異常增殖和凋亡，這可能是EP發生過程中潛在的發病機制。本研究旨在通過檢測胰島素下游信號通路關鍵蛋白PI3K、Akt的表達水平，探究EP的發生與胰島素抵抗的關系，為 EP的預防、監測及治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月至2020年3月在東南大學附屬中大醫院婦科門診就診發現宮腔異常回聲或子宮內膜增厚且行宮腔鏡診刮術的患者100例。EP組50例，納入標準：年齡<50歲伴規律月經，彩超懷疑EP，或宮腔鏡檢查組織學證實為EP者。非EP組50例，納入標準：年齡<50歲伴規律月經，宮腔鏡檢查或診刮確診無EP患者。排除標準：有宮腔鏡檢查禁忌證；長期口服性激素藥物；急性生殖器官炎癥；卵巢切除史。

1.2 觀察指標

空腹血糖(FBG)及空腹胰島素(FIN)；孕激素(P)、總睪酮(T)、泌乳素(PRL)及性激素結合球蛋白(SHBG)；總膽固醇(TCHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL- C)；游離睪酮指數(free androgen index,FAI)：FAI=[T(nmol·L-1)×100]/SHBG(nmol·L-1)；HOMA- 胰島素抵抗指數(HOMA- insulin resistance index，HOMA- IR)：HOMA- IR =[FBG(mmol·L-1)×FIN(mIU·L-1)]/22.5，HOMA- IR≥2.69判定為IR[1]。免疫組化檢測內膜組織PI3K及Akt蛋白的表達水平。

1.3 手術處理

兩組患者均于月經干凈3～7 d即子宮內膜增殖期行手術治療，EP組行宮腔鏡下內膜息肉切除術，非EP組行宮腔鏡檢查術或診刮術，術中獲取的組織標本均于10%福爾馬林固定后行病理檢查。

1.4 免疫組化檢測

1.4.1 實驗材料 新鮮組織標本固定在10%的福爾馬林中，石蠟包埋切片，冷卻成待切組織石蠟塊。采用EnVision兩步法行免疫組化檢測。

1.4.2 主要實驗試劑 磷脂酰肌醇激酶(PI3Kβ)抗體(bs- 10657R)和Akt單克隆抗體(bsm- 33325M)試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。PBS緩沖液(PH7.4～7.6)配制：每袋2 000 ml規格的PBS粉劑加入2 000 ml的蒸餾水，充分溶解。二抗檢測系統為Dako公司通用型工作液。DAB顯色劑購自Dako公司，每毫升DAB稀釋液中加入1滴DAB濃縮液。

1.4.3 實驗步驟 石蠟包埋組織塊經修整后，切片機切成2～4 μm的石蠟片，在46 ℃溫水中展片，黏附在防脫載玻片上，組織漂烘儀65 ℃烤片1～2 h，染色。

1.4.4 結果判讀 每份標本制作4張切片，其中2張分別進行2個指標的檢測，1張作陰性對照，另外1張備用。顯微圖像結果分析：在光學顯微鏡下觀察組織切片是否著色，根據染色程度及陽性細胞百分比判定結果。

1.5 統計學處理

使用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗和wilcoxon秩和檢驗，應用Pearson相關分析指標間相關性，二元多因素Logistic回歸分析篩選EP發病危險因素，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料的比較

EP組平均年齡(35.640±6.602)歲，非EP組平均年齡(36.420±6.683)歲。兩組在超重、肥胖及腹型肥胖比例上差異有統計學意義(P<0.05)，在年齡、孕次以及流產次數方面差異無統計學意義(P>0.05)，在BMI、腰圍上差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 EP組與非EP組一般資料的比較

2.2 兩組血液學指標的比較

EP組胰島素抵抗者19例(38%)，非EP組8例(16%)，差異有統計學意義(χ2=5.861，P<0.05)。EP組FIN水平、HOMA- IR明顯高于非EP組，差異有統計學意義(P<0.05)，兩組FBG差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。兩組TG、TCHO、HDL- C、LDL- C水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。兩組T、SHBG、FAI水平差異有統計學意義(P<0.05),PRL、P水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表2 EP組與非EP組血糖及胰島素水平比較

表3 EP組與非EP組血脂水平的比較

表4 EP組與非EP組血清性激素水平的比較

2.3 兩組免疫組化結果比較

陰性對照內膜組織中腺上皮細胞和間質細胞均呈藍色(圖1 A)；PI3K蛋白主要位于腺上皮細胞包膜和包質，陽性表現為胞質棕黃色(圖1 B)；Akt蛋白主要位于腺上皮細胞和間質細胞胞核，陽性表現為胞核棕黃色或棕褐色(圖1 C)。

A.PBS陰性對照；B.PI3K蛋白在內膜組織中的表達；C.Akt蛋白在內膜組織中的表達圖1 免疫組化染色結果(IHC免疫組化法 ×100)

EP組PI3K蛋白、Akt蛋白陽性表達率顯著高于非EP組，差異有統計學意義(P<0.05,表5、6),PI3K、Akt蛋白表達評分高于非EP組，差異有統計學意義(P<0.05)。采用Pearson檢驗，HOMA- IR與PI3K、Akt蛋白評分呈正相關(P<0.01)。

表5 EP組與非EP組PI3K蛋白表達情況的比較 例

表6 EP組與非EP組Akt蛋白表達情況的比較 例

3 討 論

目前有較多關于EP發生危險因素及發病機制的研究，但尚無統一定論。相關研究[4- 7]顯示，高齡、絕經時間延遲、代謝綜合征、肥胖是EP發病的危險因素，孕次增加對EP的形成有一定保護作用。本研究中EP組患者超重及肥胖人數明顯增加，結論與既往研究相符。有研究[8- 9]認為FAI是間接反映血清游離睪酮水平的良好指標。胰島素抵抗及其誘發的高胰島素血癥可導致血清T增高及SHBG降低，進而導致血清游離睪酮增高，為外周雌激素轉換提供更多的底物。另外，高雄激素血癥可抑制排卵，持續雌激素刺激最終導致子宮內膜過度增生。

國內外研究[10- 12]顯示，高胰島素血癥、IR與子宮內膜異常增生性疾病的發生顯著相關。胰島素主要通過細胞膜上的胰島素受體發揮其作用[13]。PI3K/Akt通路的靶點是一些調節脂質和碳水化合物代謝以及細胞增殖和凋亡的關鍵蛋白[14]。胰島素可通過相應受體激活PI3K/Akt信號通路，從而影響細胞的增殖和凋亡。本研究中，EP組PI3K和Akt蛋白表達評分與陽性表達率均明顯高于非EP組(P<0.05)。隨著HOMA- IR值的升高，內膜組織PI3K及Akt蛋白的表達評分也升高，HOMA- IR值與PI3K及Akt蛋白表達之間存在高度正相關關系(P<0.01)。IR通過誘導高胰島素血癥激活胰島素下游信號轉導通路PI3K/Akt途徑，進而導致內膜細胞異常增殖和凋亡，這可能是EP發生過程中的潛在發病機制。PI3K/Akt可以通過調控基因表達在細胞的存活、分化、生長、運動和凋亡等多種生理和病理過程中起到重要作用[14]。多種生長因子和信號傳導復合物，包括纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、人生長因子(HGF)、血管位蛋白1(Ang1)和胰島素，都能啟動PI3K的激活過程[15]。為了進一步明確IR、PI3K/Akt信號通路與EP之間的聯系，未來需要更嚴謹、細致的實驗，進一步驗證IR及其激活的PI3K/Akt途徑究竟是通過促進細胞增殖，還是抑制細胞凋亡，或者是加強細胞葡萄糖轉運、蛋白質合成，從而促進子EP的形成。綜上，IR和信號通路PI3K/Akt的激活是導致子宮內膜局部過度增生進而形成EP的原因之一。未來期待多中心、大樣本的研究來進一步驗證該結論。