2095例地貧初篩陽性者地中海貧血篩查及基因檢測結果分析

梁佩珍，譚曉珍，謝翠嫦，潘永康，梁志偉

1.開平市中心醫院 血液科，廣東 開平 529300；2.開平市中心醫院 檢驗科，廣東 開平 529300

0 引言

地中海貧血（以下簡稱“地貧”），又名珠蛋白生成障礙性貧血，因好發于地中海沿岸而得名，主要由α或（和）β珠蛋白基因發生突變或缺失，使得血紅蛋白中一種或幾種珠蛋白肽鏈不能合成或合成速率降低，使血紅蛋白中珠蛋白鏈生成失去平衡、造成的溶血性貧血導致[1]。據流行病調查結果顯示，我國地貧基因攜帶者主要分布于長江以南地區，尤以廣東、廣西兩省發病率最高[2]。鑒于目前仍無地貧治愈有效手段，因而重視遺傳篩查、積極預防重型地貧出生是預防地貧最有效措施。為此，本研究對2095例在本院住院、門診人群進行地貧基因檢測，以了解本地區人群地中海貧血基因突變類型及其比例，為地貧的防治工作提供科學的參考數據，對全面提高本地區地貧人群的管理水平有積極的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年3月1日-2021年9月30日開平市中心醫院接收的2095例地貧初篩陽性患者進行地中海貧血基因檢測，年齡0～83歲，其中男648例，女1447例。本研究經倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

采用邁瑞BC-6900全自動血液細胞分析儀檢測血常規的紅細胞數量，平均紅細胞體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）。采用BIO-RAD/CFX96實時熒光定量PCR擴增儀提取DNA，檢測試劑主要使用亞能生物技術有限公司提供的α-地中海貧血點突變基因診斷試劑盒、α-地中海貧血基因檢測試劑盒及β-地中海貧血基因診斷試劑盒、DNA提取液。

1.3 檢測方法

1.3.1 血細胞分析

采集患者外周靜脈血2mL，置于EDTA抗凝管中混勻，行血常規檢測，MCV＜82fL和/或MCH＜27pg作為為地貧初篩陽性。

1.3.2 地貧基因組DNA提取

采用全自動核酸提取儀磁珠法提取患者DNA。

（1）以多重跨越斷裂點PCR（gap-PCR）技術檢測3種缺失型α-地貧基因類型（--SEA、-α3.7和-α4.2）：25μL反應總體積中基因組DNA 3μL、酶混合物1μL，反應參數為96℃ 5min，98℃ 45s、64℃ 90s、72℃ 180s，完成35個循環后更換參數為72℃ 5min，取每管反應產物1.5μL，加1.0%瓊脂糖凝膠加樣孔中，穩壓電泳約50min，并于UV燈下觀察基因缺失分型。

（2）以PCR-寡核苷酸探針反向斑點雜交法（PCR-RDB）進行3種非缺失型α-地貧基因突變類型（ααCS、ααQS、ααWS）及17種β-地貧基因突變類型（CD41-42、IVS-II-654、-28、CD71-72、CD17、βE、IVS-I-1、CD27-28、CD43、-29、CD31、-32、-30、CD14-15、CAP、Int、IVS-I-5）檢測。取3μL樣本加至反應擴增管中，循環參數為50℃ 15min，95℃ 10min，94℃1min、55℃ 30s、72℃ 30s，完成35個循環后更換參數為72℃ 5min，循環完成后取管中PCR產物、A液、膜條于15mL塑料管中，沸水加熱10min，取出后43℃恒溫振蕩器雜交1.5～4h，膜條洗膜后加酶顯色觀察結果。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，采用描述性統計方法，分析地貧基因的突變類型及構成比，地貧突變基因檢出率、構成比以百分比表示（%）。

2 結果

2.1 地貧基因檢測結果分析

在2095例地貧篩查陽性患者中檢出地貧基因陽性881例，檢出率42.05%；其中檢出α-地貧566例，占地貧基因陽性的64.25%，β-地貧273例，占30.99%，α復合β-地貧42例，占4.77%，見表1。

表1 開平地區地貧篩選結果分析（n，%）

2.2 α-地貧基因類型及其構成比

在566例α-地貧患者中，包含14種基因型，以--SEA/αα型354例（62.54%）、-α3.7/αα型92例（16.25%）、-α4.2/αα型46例（8.13%）為主，α-地貧各基因型及構成比，見表2。

表2 開平地區α-地中海貧血基因類型及其構成比結果（n，%）

2.3 β-地貧基因類型及其構成比

在檢出β-地貧273例中，包含11種基因型，以CD41-42型103例（37.73%）、IVS-II-654型73例（26.74%）、-28型50例（18.32%）為主，β-地貧各基因型及構成比，見表3。

表3 開平地區β-地中海貧血基因類型及其構成比結果（n，%）

2.4 α復合β-地貧基因類型及其構成比

檢出α復合β地貧42例，占4.77%，包含20種基因型，以--SEA/αα復合CD41-42型7例（16.6%）、ααWS/αα復合CD41-42型5例（11.9%）、-α3.7/aa復合IVS-II-654型3例（7.14%）為主，α復合β-地貧各基因型及構成比見表4。

表4 開平地區α 復合β 地中海貧血基因分布情況（n，%）

3 討論

作為我國最常見的單基因遺傳病之一，地貧可根據病癥大致分為靜止型、輕型、中間型、重型。其中，靜止型通常無明顯臨床表現，部分輕型患者則可能會有輕度肝脾腫大、貧血等癥狀，而中間型、重型地貧患者則可隨年齡增長出現特殊面容（頭顱變大、眼距寬、鼻梁凹陷等），并伴有溶血性貧血、肝脾腫大、發育遲緩等表現[3]。目前，地貧治療仍缺乏有效手段，輸血、祛鐵、脾切除術等姑息方式是臨床最常用的治療手段，雖無法治愈，但可緩解病情達到改善生存質量的目的，而造血干細胞移植作為重型地貧患者治療首選方法，治療難度大、方案復雜，對患者的承受能力及經濟能力要求較高[4]。因此，提高婚檢、孕前和產前的地貧基因篩查意識，降低重癥地貧患兒出生率才是實現有效防控、減輕地貧危害、提高人口質量的首要任務。

開平市位于廣東省中南部，隸屬廣東省江門市，人口眾多，且在地理位置上屬于東南部，是地貧的高發流行地區之一，因此，對我市開展地貧篩查診斷提供科學參考，對全面提高本地區地貧人群的管理水平有積極的意義。本次篩查涉及住院、門診體檢、婚檢、產檢人群等多種人群，研究面廣、樣本量較大，對于開平地區地貧基因攜帶情況具有一定反映價值，其結果對于開平地區地貧人群的管理和防控具有重要參考價值。

MCV、MCH是血液學中地貧篩查的重要指標，但鑒于此種常規檢測無法區分地貧與缺鐵性貧血，因此本研究采用血常規篩查及地貧基因檢測技術對血液樣本檢測，以提高篩查準確度[5-6]。結果顯示，在2095例地貧篩查陽性患者中檢出地貧基因陽性881例，檢出率42.05%，與賀志軍等研究報道順德地區地貧基因篩查陽性率39.17%接近[7]。

α-地貧由α珠蛋白肽鏈合成減少引起，包括基因大片段缺失、核苷酸缺失或插入（非缺失）突變兩大類[8]。本研究以Gap-PCR技術檢測3種常見缺失型（--SEA、-α3.7和-α4.2）、PCR-RDB檢測3種非缺失型基因類型（ααCS、ααQS、ααWS[9]）。結果發現，共有α-地貧566例，占地貧基因攜帶者的64.25%，提示本地區地貧基因篩查分布以α-地貧為主，結果與周冰焱等[10]研究的廣東地區地貧基因型分析研究結果相吻合。在566例α-地貧患者中共包含基因型14種，以--SEA/αα型354例（62.54%）、-α3.7/αα型92例（16.25%）、-α4.2/αα型46例（8.13%）為主，此結果提示開平地區地貧患者以缺失型為主，與文獻報道廣東地區地貧篩查結果相符[11]。

β-地貧的分子基礎與β珠蛋白基因發生突變，核苷酸的缺失、插入或置換有關,采用PCR-RDB技術可檢測我國居民最常見的17種β地貧基因突變類型，可作為β地貧基因診斷的可靠方法[12]。結果發現，共有β-地貧血273例，占30.99%，β地貧患者中包含基因型11種，以CD41-42/N型103例（37.73%）、IVS-II-654/N型73例（26.74%）、-28/N型50例（18.32%）為主，與徐韞健等[13]的報道研究廣東地區β-地貧以CD41-42/N突變型最高的檢測結果一致。

此外，本研究還檢測出α復合β-地貧42例，僅占地貧基因陽性標本中4.77%，低于劉玲等[14]研究報道的廣東地區的6.4%，42例復合基因型中包含20種基因型，突變類型多變，其中以--SEA/αα復合CD41-42/N型占比最高，與馮建江[15]報道的江門地區結果一致。由此可得，在地貧防控中需引起注意，僅僅依靠血液學篩查不能診斷α復合β-地貧，需要同時檢測α-地貧基因（缺失型和點突變型）和β-地貧基因，避免漏診[16]。而且在婚育檢查中更引起重視，必需行夫妻雙方的基因診斷，避免多重復合基因的重型地貧患兒出生。

綜上所述，結合血液學篩查與基因型診斷，開平地區地貧基因檢出率較高，且突變類型多樣，α-地貧以--SEA/αα型最常見，β-地貧以CD41-42/N型最常見，在地貧防控上需引起重視。