罕見B(A)亞型的鑒定及家系分析

劉建成

寧夏回族自治區(qū)血液中心血型參比實驗室,寧夏銀川 750011

ABO血型是發(fā)現(xiàn)和確定的人類第一個血型系統(tǒng)，其抗原性和免疫原性最強，能夠引起嚴重的溶血性輸血反應、新生兒溶血癥等疾病。目前，通常采用免疫血清學方法來鑒定ABO血型，但在實際工作中經常會遇到正反定型不相符或者凝集反應較弱的情況，這是因為除了正常的ABO血型之外還存在一些ABO亞型[1-2]。正確地鑒定ABO血型至關重要，B(A)亞型便是一種較為稀有的亞型，在血型鑒定時除了免疫血清學方法之外還需要通過基因分型的方法才能正確鑒定其血型，它在我國北方的獻血者中頻率為1/(5～10)萬[3]。

1 材料與方法

1.1標本來源 先證者來自于健康的獻血者，符合獻血標準。經過知情同意隨后采集了先證者父親和母親的血液標本。

1.2試劑與儀器 正定型抗-A、抗-B，反定型A細胞、B細胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司)；ABO血型基因分型試劑盒(天津秀鵬公司)；全血基因組DNA提取試劑盒(天根生物公司)；DNA 聚合酶(大連TaKaRa)；測序引物(上海生工公司合成)以上所有試劑均在有效期內；PCR擴增儀(ABI Veriti DX)；凝膠成像儀(SYNGENE G:BOX)；Nanodrop One超微量分光光度計(基因有限公司)；3730測序儀(美國ABI公司)。

1.3免疫血清學方法 ABO正反定型檢測按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》和參照文獻[4]進行。

1.4基因分型方法

1.4.1全血基因組DNA提取 按照試劑盒說明書操作，DNA濃度和純度經超微量分光光度計測定，最終濃度稀釋為50 ng/μL。

1.4.2PCR-SSP檢測 按照天津秀鵬PCR-SSP擴增說明書進行操作，擴增程序見表1。內參質控為人類生長激素基因的保守片段。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 PCR-SSP程序

1.4.3ABO基因測序 擴增ABO基因第6、7外顯子進行測序。反應體系為30 μL，其中DNA模板3 μL，Taq酶(10 mmol/L)0.3 μL，10×緩沖液3 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，測序引物(10 μmol/L)3 μL，ddH2O 16.7 μL。擴增反應程序見表2，上下游引物序列見表3，PCR產物純化后直接進行測序。

表2 第6、7外顯子 PCR擴增反應程序

表3 第6、7外顯子擴增引物序列

1.4.4序列分析 利用軟件DNAMAN分析測序結果，與GenBank中的序列進行比對。

2 結 果

2.1血型血清學結果 先證者血型呈現(xiàn)正反定型不一致，正定型與抗-A和抗-B均有凝集，抗-A為弱凝集1+，與抗-H反應強凝集。反定型只與A細胞呈現(xiàn)凝集，血清學表型為AwB。先證者和家系成員血型反應格局結果見表4。

表4 先證者及家系成員ABO血型反應格局

2.2ABO血型基因分型結果 通過PCR-SSP檢測發(fā)現(xiàn)先證者基因型為B/O，先證者父親基因型為A/O，先證者母親基因型為B/O。結合血型血清學結果先證者父親基因型和血清學結果一致為正常的A型。先證者和其母親的基因型和血清學結果不一致，進一步通過測序發(fā)現(xiàn)先證者和母親的B基因均發(fā)生了700C>G點突變，與GenBank中的序列進行比對，參照紅細胞抗原突變數(shù)據庫ABO等位基因的命名，先證者和母親ABO等位基因為B(A)02，為雜合子。

3 討 論

截至目前，共發(fā)現(xiàn) 43個血型系統(tǒng)，400多個抗原[5-6]。ABO血型一般指A、B、O、AB 4種血型。ABO亞型是在這4種血型基礎上進一步細分而命名的血型，具有遺傳基礎和免疫血清學特點，由于疾病等無法遺傳的原因導致的血型改變不能稱為亞型，有些雖然基因發(fā)生改變但是不影響免疫血清學特點的血型也不是亞型[7-8]。至今已經發(fā)現(xiàn)有60多種A亞型和30多種B亞型，A亞型有A1、A2、A3、Ax等，B亞型比A亞型少見，有B2、B3、Bx、B(A)等[9]。 ABO亞型抗原的結構、性質以及數(shù)量與正常的ABO血型抗原存在一定差異，主要是由于基因突變、糖基轉移酶的活性、底物等原因造成的[10-11]。

B(A)亞型在ABO亞型中發(fā)生率非常低，在基因水平上被認為是B型，在細胞水平上表達了正常的B抗原和較弱的A抗原[12]。B(A)亞型的血清學特點是正定型紅細胞與抗-B和抗-H凝集強度較強，與抗-A凝集較弱或者不凝集，反定型血清中含有較強的抗-A抗體[13-14]。本文中先證者和其母親的免疫血清學結果初步判定為AwB亞型，經基因分型鑒定為B(A)亞型。1985年，B(A)亞型最早被發(fā)現(xiàn)，有學者闡釋了B(A)亞型的發(fā)生機制，發(fā)現(xiàn)了第一個能夠編碼正常的B糖基轉移酶且該酶同時具有A糖基轉移酶的活性的等位基因，命名為B(A)01[15]。至今，共發(fā)現(xiàn)6種B(A)等位基因，分別為B(A)01、B(A)02、B(A)03、B(A)04、B(A)05、B(A)06[15]。與常見的B101基因序列相比，B(A)等位基因存在1～2個堿基的點突變，這些突變影響了編碼B糖基轉移酶的3個氨基酸的翻譯，導致B糖基轉移酶同時具有了A糖基轉移酶的活性。在我國，最常見的等位基因是B(A)02和B(A)04[16]。本文中先證者和其母親的B(A)亞型表型是由B(A)02等位基因引起的，與通常的B101基因堿基序列比對，B(A)02等位基因發(fā)生了一個nt700C>G 點突變，導致編碼翻譯的α-1,3-半乳糖轉移酶除了能夠合成B抗原之外還能合成少量的A抗原。先證者的父親為正常的A型，母親為B(A)亞型，說明先證者的B(A)02等位基因遺傳于其母親。

在鑒定ABO血型的時候，由于免疫血清學的局限性，ABO亞型的鑒定存在一定的困難，非常容易將B(A)亞型誤判為AwB型，對輸血造成了一定的風險，所以發(fā)現(xiàn)ABO血型正反不符時可以進一步利用基因分型的方法準確鑒定血型，保證安全、有效地輸血治療。B(A)亞型的獻血者可以加入稀有血型庫進行保留，捐獻的血液可以制備成冰凍紅細胞進行保存。若患者為B(A)亞型需要輸血時，很難找到同型血液，可以輸注O型或B型洗滌紅細胞，也可以采取自體輸血進行治療。