陜西地區靜脈血栓栓塞癥患者 MTHFR和MTRR基因多態性分析以及對臨床診療的指導意義

張李婷，馬文兵,2*，關 棟，鄧 祥

(1.西安交通大學第一附屬醫院 藥學部，陜西 西安710061；2.西安交通大學生命科學與技術學院，陜西 西安710049)

靜脈血栓栓塞癥(VTE)是臨床常見的一種血管綜合征，由深靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)構成，是同一疾病的兩種不同形式。目前，靜脈血栓已成為心血管疾病的第三位病因，也是肺癌等癌癥的常見并發癥[1]。VTE是一種復雜的多因素疾病，基因突變在其中發揮著重要作用[2]，但VTE基因突變具有很大的民族和地域特征。尋找特異度高的診斷標志物，對VTE的治療及預防具有重要意義。近年來研究發現，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因多態性可能與深靜脈血栓形成存在相關性[3]。MTHFR和MTRR基因變異引起相應的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸轉化為甲硫氨酸，導致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥(HHcy)。HHcy對血管內皮細胞具有較大的毒性刺激作用，會引起內皮細胞功能損害，導致血小板黏附性增強，同時能夠在血管內引起一系列的氧化應激反應，使脂質代謝紊亂，這一系列過程均會促進血栓的形成[4]。本研究通過對陜西地區VTE患者進行MTHFR和MTRR基因檢測，探討MTHFR和MTRR基因多態性與VTE發病風險的相關性，為VTE的防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 數據來源

檢索Pubmed、Web of Science、中國學術期刊全文數據庫、萬方科技期刊全文數據庫。英文檢索詞為“venous thrombosis”“MTHFR”“MTRR”“Gene”，中文檢索詞為“靜脈血栓”“MTHFR”“MTRR”“基因多態性”等，各檢索詞以“and”/“和”連接，按需要組合。

1.2 一般資料

選取2019-2020年本院診斷為靜脈血栓栓塞并行MTHFR和MTRR基因多態性檢測的患者439 例，其中男性285例，女性154例；年齡 16-94 歲，平均年齡(64.5±13.1) 歲。所有患者籍貫均為陜西地區漢族人口，無血緣關系，否認家族遺傳病病史。

1.3 納入標準

年齡≥16歲，符合臨床靜脈血栓栓塞診斷標準；排除肝腎功能嚴重損害患者,任何有凝血傾向高危患者,妊娠和哺乳期婦女,合并血液學、嚴重感染性疾病以及腫瘤的患者。

1.4 監測方法

患者靜脈抽血2 ml置于EDTA抗凝管中，將待檢血液標本顛倒混勻數次，吸取100 μl加入到400 μl樣本萃取液(CQ-ENH型，濟南廣音醫療科技有限公司)中，混勻，上下顛倒震蕩離心管10次，使血樣與樣本萃取液混勻，然后置于離心管架，靜置10 min，待紅細胞充分裂解，至呈現透明的紅色液體。將靜置后的透明紅色液體，離心去除上清，白細胞萃取完成。取1.5 μl白細胞混懸液加到1支地高辛染色液，充分混勻并短暫離心，完成后蓋緊管蓋，置入熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司生產的多通道熒光定量分析儀Fascan 48S)。采用熒光染色原位雜交及染色體核型分析系統自動判讀熒光信號值，獲取熒光曲線圖，進行MTHFR(677C>T)和MTRR(66A>G)基因分型，并作陽性質控。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

對陜西地區VTE患者MTHFR(677C>T)和MTRR(66A>G)基因位點的檢測數據進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(χ2=0.4556，P=0.4997；χ2=0.8189，P=0.1811)，檢驗結果符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，該樣本具有區域群體代表性。見表1。

表1 陜西地區VTE患者MTHFR和MTRR基因Hardy-Weinberg遺傳平衡分析

2.2 439例VTE患者MTHFR和MTRR基因型及等位基因分布

在439份檢測標本中，MTHFR和MTRR基因型分布由多到少分別為CT、TT、CC；AA、AG、GG，分別占患者總數的48.06%、30.07%、21.87%；67.43%、28.93%、3.64%。MTHFR CC及TT等位基因頻率分別為45.90%和54.10%；MTRR AA和GG等位基因頻率分別為81.89%和18.11%。見表2。

2.3 不同性別VTE患者MTHFR和MTRR基因型及等位基因頻率分布

本研究將VTE患者分為男、女兩個組，結果顯示，男、女患者MTHFR和MTRR基因型分布差異無統計學意義(χ2=1.072，P=0.585;χ2=0.164，P=0.921)，等位基因分布差異無統計學意義(χ2=1.094，P=0.296;χ2=0.167，P=0.683)。見表2。

表2 不同性別的患者MTHFR和MTRR基因型及等位基因分布

2.4 不同年齡段VTE患者MTHFR和MTRR基因型及等位基因頻率分布

本次研究將VTE患者分為四個年齡段，分別為≤40歲、40-60歲、60-80歲和>80歲。結果顯示，不同年齡段患者MTHFR和MTRR基因型分布無統計學意義(χ2=8.500，P=0.204;χ2=7.989，P=0.239)，等位基因分布也無統計學意義(χ2=6.931，P=0.074;χ2=2.701，P=0.440)。見表3。

表3 陜西地區與國內外其他地區VTE人群MTHFR基因型以及等位基因分布頻率比較

表3 不同年齡患者MTHFR和MTRR基因型及等位基因分布

2.5 陜西地區VTE漢族患者與國內外其他地區VTE人群MTHFR基因分布及等位基因分布比較

比較陜西地區VTE漢族患者和國內外其他地方人群，各少數名族以及不同種族之間MTHFR基因分布及等位基因分布差異。結果顯示，陜西地區漢族VTE人群MTHFR基因型以及等位基因分布與歐美亞國家韓國、俄羅斯、荷蘭、美國、希臘、加拿大、奧地利、土耳分布情況比較差異具有統計學意義(P<0.05)，與我國其他地區臺灣、福建、廣西、廣東、南昌和新疆分布情況比較差異具有統計學意義(P<0.05)，與南京、沈陽、鄭州、湖南分布情況比較差異無統計學意義(P>0.05)。陜西地區漢族VTE人群MTHFR基因型分布與北京、哈爾濱比較差異無統計學意義(P>0.05)，而MTHFR等位基因分布與北京、哈爾濱比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

3 討論

VTE是一種常見且嚴重的血栓疾病，是全球范圍內可預防的主要疾病和死亡的原因[24]。越來越多的研究證實VTE是一種復雜的、多因素的疾病，是由易感性與遺傳和獲得性危險因素相互作用的結果。近年來，關于MTHFR基因多態性與VTE發病風險關系的研究報道較多，但結論不一致。有學者認為MTHFR多態性與VTE易感性有相關性[25]，但也有研究表明兩者之間沒有相關性[26]，除MTHFR C677T多態性外，MTRR A66G多態性是否能增加VTE易感性也是一個高度爭論的問題。MTHFR和MTRR是葉酸代謝系統中的關鍵酶，其基因多態性可導致葉酸代謝關鍵酶活性降低，研究發現，若MTHFR第677位和MTRR的第66位產生突變，會導致相應的酶活性下降，影響DNA的合成和甲基化異常、引起葉酸代謝障礙，可能引起Hcy水平上升，Hcy是由蛋氨酸轉化為半胱氨酸而形成的一種中間氨基酸，許多研究報道血栓性事件后，HHcy 是一種重要的獨立促凝因子[27-28]，也是VTE的危險因子[29-30]。因此，通過檢測VTE患者的MTHFR和MTRR基因多態性對于個體化使用葉酸治療意義重大，為VTE的防治提供理論依據。

本研究對陜西人群中VTE患者的MTHFR和MTRR基因多態性進行分析。通過對陜西地區439例漢族VTE人群進行基因檢測，結果顯示，陜西省漢族VTE人群MTHFR CC及TT等位基因頻率分別為45.90%和54.10%；MTRR AA和GG等位基因頻率分別為81.89%和18.11%。此外，MTHFR和MTRR基因型在439例臨床樣本中的分布頻率，其中以CT(211)和AA(296)為主，分別為48.06%和67.43%，這一結果與楊博逸等人研究相似[31]。另外分析了不同性別VTE患者MTHFR和MTRR基因型、等位基因分布沒有差異，說明性別對陜西地區MTHFR和MTRR基因多態性無明顯影響。不同年齡段患者MTHFR和MTRR基因型以及等位基因分布無統計學意義，本次研究樣本基數較大、年齡跨度大以及性別分布均衡，能夠全面地體現陜西地區MTHFR和MTRR基因多態性的分布特征。

MTHFR基因型和等位基因頻率分布有種族、地域的差異。CC基因型酶活性能夠達到100%，CT基因型酶活性只有65%，而TT基因型酶活性僅有30%，酶活性降低將導致活性葉酸生成不足，同型半胱氨酸水平升高。大量研究證實我國MTHFR C677T位點突變頻率較高，且存在顯著的地理和種族差異[32]。本研究發現陜西地區的VTE人群TT純合子等位基因和基因型突變頻率分別為54.10%和30.07%，這一結果和其他研究相近[12]。陜西地區的VTE人群TT純合子基因型突變頻率遠遠高于其他國家如荷蘭人約為10.06%,希臘人約為13.64%，加拿大人約為14.73%，奧地利人約為9.68%，土耳其人約為8.75%，墨西哥人約為13.68%,美國約為20.71%，韓國人約為23.15%。我國MTHFR C677T位點TT基因型頻率平均約23.2%，但是南北地區之間似乎存在一定的差異。南方VTE人群TT基因型頻率相對較低，如臺灣(8.04%)、福建(8.34%)、廣東(7.14%)，廣西(26.67%)、湖南(18.87%)，而南昌(32.67%)、南京(25.00%)卻高于陜西地區；陜西地區VTE人群TT基因型頻率與中部城市鄭州(27.18%)接近，而低于北方城市如新疆(28.40%)、哈爾濱(38.36%)、沈陽(33.33%)，從上述數據上發現，我國TT基因型頻率整體上呈現出北高南低的分布特點，這與Huang等研究結果一致[33]。本研究表明，不同國家、地區之間代謝型存在著一定差異，不同地區漢族MTHFR基因表型分布也存在差異。因此，通過MTHFR和MTRR基因檢測評估VTE患者的血栓風險從而對于高風險的患者進行強化抗栓治療可能會為該類患者帶來獲益。

綜上研究表明，陜西地區VTE患者MTHFR和MTRR基因型主要以 CT、AA為主，等位基因以T和A為主，不同性別、年齡段患者基因型及等位基因分布差異均無統計學意義。本研究還通過對陜西地區VTE患者MTHFR基因多態性與國內外其他地區的對比分析，結果發現與國外MTHFR基因型以及等位基因分布均有差異，與我國其他地區臺灣、福建、廣西、廣東、南昌和新疆分布情況比較有差異，與南京、沈陽、鄭州、湖南分布情況比較無差異。陜西地區漢族VTE人群MTHFR基因型分布與北京、哈爾濱比較無差異，而MTHFR等位基因分布與北京、哈爾濱比較有差異。通過MTHFR和MTRR基因檢測不僅有助于篩查高危人群，同時為臨床醫生進行強化抗栓治療以及使用葉酸提供一定的參考依據。