低溫等離子體對粳稻表面霉菌的抑制作用及其品質的影響

謝 輝, 王建峰, 曹 涌, 劉興泉, 李 玲, 郭 儉

(浙江農林大學食品與健康學院; 現代糧食產業學院，杭州 311300)

稻谷是我國第一大糧食作物，其總產量與播種面積位居世界第一[1]。稻谷作為主要的糧食食用品種，供應著一半以上人口的口糧[2]。據聯合國糧食及農業組織(FAO)2019年對全球農產品各環節糧食損失指數估計，全球約14%的糧食在從生產至零售環節之前被損失掉，約3.8億t[3]。據2020年國家糧食和物資儲備局數據顯示，我國每年有約700億斤的糧食在儲藏、運輸和加工等環節不斷損失[3]。這對我國儲糧工作提出了更高的要求。

為提高稻谷耐儲性及品質，常用于稻谷儲藏的技術有低溫儲藏技術、氣調儲藏技術和藥劑熏蒸技術等。然而，低溫儲藏技術和氣調儲藏技術對倉房的氣密性和隔熱性要求嚴格，倉房的改造費用昂貴，稻谷儲藏成本較高[4]。而使用藥劑熏蒸會不斷提高儲糧害蟲的耐藥性，必須不斷提高熏蒸藥劑的濃度才能實現有效熏蒸[5]。

等離子體，又稱為電漿，被認為是物質除固態、液態、氣態的第四態，是原子或分子被電離后產生的離子化氣體狀態物質，可以分為高溫等離子體和低溫等離子體[6]。當電子溫度遠高于離子溫度，體系處于非熱平衡狀態時，體系中的氣體為輕度電離，放電溫度接近室溫，故被稱為低溫等離子體。低溫等離子體是一種新型食品冷殺菌技術，通過電離空氣產生活性物質作用于食品表面的微生物達到殺菌的目的[7],具有高效、快捷、安全無污染等優點。目前，該技術已在如肉類、果蔬和水產品等食品中有相關的應用研究[8-10]。徐慧倩等[11]證實低溫等離子體能有效減緩南美白對蝦的腐敗變質，并且隨著冷藏時間的變化，經過低溫等離子體處理的南美白對蝦的質構特性、色澤的保持效果都顯著優于對照組。喬維維等[12]研究發現低溫等離子體能夠有效殺滅牛肉表面的微生物，降低牛肉的細菌殘留量，并且較好保持牛肉的色澤。因此，低溫等離子體在農產品保鮮和儲藏上的應用也越來越廣泛[13]，但目前該技術應用于糧食儲藏方向的相關報道較少。

前期課題組通過對倉儲稻谷霉菌群落進行分析，選擇亮白曲霉、黑曲霉、米根霉、草酸青霉4種稻谷儲藏優勢霉菌作為研究對象，研究低溫等離子體對粳稻表面4種霉菌的抑菌效果與粳稻的品質變化之間的關系，為低溫等離子體技術應用于糧食安全儲藏領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 稻谷樣品

稻谷采自浙江省中央儲備糧庫中的粳稻谷，采用 3 層、5 點取樣法，分別在糧倉東南角、東北角、西南角、西北角以及中央點作為取樣點，每個取樣點分別在距糧堆表層 0.5 m、中央層、距地面 0.5 m 取樣。每倉 15 個取樣點，樣品放置在無菌采樣袋中，于4 ℃保存。

圖1 介質阻擋放電等離子體裝置示意圖

1.2 主要儀器與設備

介質阻擋放電等離子體裝置，其示意圖如圖1，工作電壓：20 kV。定制交流高壓電源：GR-A-P30-150Ma型，MJ-系列恒溫培養箱，T6新世紀可見分光光度計，JLG-Ⅱ礱谷機，LC-20A液相色譜儀，GCMS-QP201PLUS氣相色譜質譜聯用儀。

1.3 指標及測定方法

低溫等離子體裝置操作：將需要處理的樣品放到培養皿中，再將其放到如圖1所示的DBD處理室中，打開電源，將電壓調到20 kV，處理相應的時間。

真菌的活化：草酸青霉(PenicilliumoxalicumACCC 32574)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，28 ℃培養5 d，5 ℃儲藏。米根霉(RhizopusoryzaeCICC 3010)和黑曲霉(AspergillusnigerCICC 2041)用PDA培養基, 28 ℃培養5 d，5 ℃儲藏。亮白曲霉(AspergilluscandidusACCC 30347)用014馬鈴薯葡萄糖瓊脂，28 ℃培養5 d，5 ℃儲藏。真菌的活化可參考《菌種活化操作方法》[14]。

稻谷常見真菌活性的測定：將用1%次氯酸鈉溶液處理過的無菌干燥稻谷分為9組。取5 g無菌稻谷浸泡到等量含有真菌的生理鹽水中，使其充分接觸。再將9組稻谷分別進行0～8 min低溫等離子體處理，然后放入裝有45 mL生理鹽水的藍口瓶中超聲洗去稻谷表面的真菌。選取合適梯度的稀釋液100 μL到凝固好的平板培養基，按涂布法涂勻后用封口膜密封于28 ℃的MJ-系列霉菌培養箱中培養。記錄菌落數量，計算抑菌率。

稻谷中蛋白質組分的測定：稱取分別經過0～8 min處理的米粉各0.1 g，共9組，參考楊靜等[15]的連續提取法，依次用蒸餾水、2%氯化鈉、75%乙醇和0.04 mol/L氫氧化鈉4種溶劑對清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白進行分離提取，然后采用考馬斯亮藍法依次對各組分蛋白含量進行測定。

稻谷中淀粉含量的測定：稱取經過等離子體處理0～8 min的米粉各2 g，共5組，參照 GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》中的酸水解法進行測定。

稻谷脂肪酸組分的測定：分別取經過0～8 min處理過的米粉各2.5 g，共5組，放置于50 mL離心管中。加入25 mL石油醚，在42 ℃，300 W的條件下超聲37 min后以4 000 r/min離心10 min。取上清液至圓底燒瓶中，于旋轉蒸發儀上50 ℃旋蒸至無石油醚，烘干至恒重。加入0.5 mL 5 mg/mL十一烷酸甘油三酯標液(125 mg十一烷酸甘油三酯加25 mL甲醇)和25 mg焦性沒食子酸。加入2 mL正己烷于圓底燒瓶中并轉移到10 mL的具塞試管中，加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，充分振蕩后于70 ℃水浴15 min，隨后加入4 mL 0.5 mol/L的H2SO4-CH3OH在70 ℃水浴鍋中水浴5 min，冷卻至室溫，加入2 mL正己烷和2 mL蒸餾水，加0.2 g NaCl，充分振蕩后靜置，取上層液體過膜，上機分析。

1.4 數據分析

采用Excel處理數據計算平均值和標準差，使用SPSS24和Origin2019b軟件進行單因素分析和作圖。

圖2 不同處理時間下低溫等離子體對對粳稻中4種霉菌的影響

2 結果與分析

2.1 稻谷真菌抑菌率

由圖2可知，隨著低溫等離子體處理時間的增長，根霉、黑曲霉、草酸青霉和亮白曲霉的抑菌率總體上呈上升趨勢。根霉在處理時間到達3 min后，其抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在處理時間到達8 min時，抑菌率可達到72%。這說明低溫等離子體對米根霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。黑曲霉在處理時間到達3 min后，其抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在6 min之后，抑菌率基本保持不變趨向于平緩；在處理時間到達8 min時，黑曲霉的抑菌率可達到79%。這說明低溫等離子體對黑曲霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。草酸青霉在處理時間到達2 min后，抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在處理時間到達8 min時，其抑菌率可達到64%。這說明低溫等離子體對草酸青霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。亮白曲霉在處理時間到達2 min后，抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在處理時間到達8 min時，對亮白曲霉的抑菌率可達到66%。這說明低溫等離子體對亮白曲霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。

隨著低溫等離子體處理時間的增長，低溫等離子體對4種霉菌的抑菌率均有顯著提高(P<0.05)。Niemira等[16]利用等離子體處理蘋果時，也發現處理組的殺菌率隨處理時間的增加而增加。Misra等[17]利用等離子體抑制櫻桃表面的細菌，結果發現隨著處理時間的延長，抑菌率逐漸提高。

2.2 粳稻蛋白質組分

稻谷中蛋白質含量與品種有關，含量高有利于大米的吸水膨脹和糊化，增加大米黏性，改善口感[18]。由圖3可知，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的含量一開始都先隨處理時間而提高。清蛋白含量在2 min后便趨于平衡，不會隨處理時間發生顯著變化。而球蛋白含量在處理5 min后又隨處理時間而增多。醇溶蛋白含量在2 min時達到最大值1 642.2 μg/g后又趨于平穩，直到7 min。這可能是因為低溫等離子體中的高能電子和活性氧等物質破壞了稻谷細胞壁組成成分里的共價鍵實現對稻谷表面的蝕刻，使稻谷表面出現凹陷和裂痕[19,20]，從而導致稻谷內部的清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白更容易被提取出來。

圖3 不同處理時間下低溫等離子體 對粳稻蛋白質組分含量的影響

谷蛋白含量隨處理時間先減少，到1 min后谷蛋白含量隨處理時間趨于平緩，無顯著變化。有研究表明，水稻種子的谷蛋白主要由分子質量為36 000和22 000兩種亞基通過雙硫鍵結合形成的[21],而低溫等離子體對雙硫鍵可能會有破壞作用[22]。雖然，谷蛋白含量也可能因為低溫等離子體對稻谷表面的蝕刻作用而提高，但是低溫等離子體降解谷蛋白的數量大于谷蛋白由于蝕刻作用而多提取出來的數量，總體上谷蛋白含量是下降的。醇溶蛋白含量在 7 min后降低(P<0.05)，也可能是這一原因所造成的。另外，等離子體對二硫鍵的破壞作用，可以在一定程度上提高米飯的黏度，提升米飯的食用品質[23]。

2.3 粳稻淀粉含量

淀粉是稻谷中的主要成分，是影響稻谷食用品質的重要因素之一。圖4為不同處理時間下粳稻的淀粉含量變化，與對照組相比，處理時間為4 min的淀粉含量無顯著變化，而處理時間為6、8 min時，與對照組相比，粳稻的淀粉含量有所下降(P<0.05)，這可能是因為處理時間過長導致部分淀粉被氧化分解。這說明適當的低溫等離子體處理對粳稻的淀粉含量無顯著影響，但是處理時間過長會導致粳稻淀粉下降(P<0.05)。并且結合抑菌率實驗，可以發現跟對照組相比，在處理時間為4 min時，4種真菌的抑菌率均已顯著提高(P<0.05)。所以只要控制合適的處理時間，就可以在不影響稻谷的淀粉含量的前提下，有效抑制稻谷霉菌生長。雖然高強度的等離子體處理會使淀粉含量降低，但同時也能改性淀粉的某些功能。比如Zou等[24]發現，等離子體可以使淀粉的羥基極化，在不破壞淀粉主體結構的情況下促進淀粉的交聯。Thirumdas等[25]研究發現，經等離子體處理后，大米的蒸煮時間有效縮短，并且其吸水率提高。

表1 不同處理時間下低溫等離子體對粳稻的脂肪酸組分的影響/%

圖4 不同處理時間下低溫等離子體 對粳稻淀粉含量的影響

2.4 稻谷脂肪酸組分

稻谷自身的呼吸作用和一些環境因素的影響會使稻谷籽粒中的脂類物質水解而產生游離脂肪酸，這些游離脂肪酸不穩定很容易發生酸敗現象從而影響稻谷品質，因此根據脂肪酸組分的變化可以衡量稻谷品質是否受到影響。并且不飽和脂肪酸對人體健康具有重要作用，如α-亞麻酸和二十碳五烯酸具有促進大腦發育、保護視力、降血脂和預防心血管疾病等多種生理作用[26]。對處理0、2、4、6、8 min時間里的稻谷進行脂肪酸組成成分的鑒定，經過譜庫檢索匹配，整理出了相似度較大的11種脂肪酸，如表1所示。經過低溫等離子體處理4 min后，只有十五烷酸的含量與對照組相比略有提高(P<0.05)。但是隨著處理時間的繼續延長， 十五烷酸含量無顯著變化。而低溫等離子體處理對其余10種脂肪酸均無顯著影響。盡管低溫等離子體中存在羥自由基、超氧陰離子自由基和過氧化氫等物質，會對不飽和脂肪酸產生氧化作用[27]，但是由表1可知，粳稻的亞麻酸、反-9-十八碳烯酸和反-11-二十碳烯酸這些不飽和脂肪酸的含量并未減少，甚至反-11-二十碳烯酸含量還會升高。產生這種現象的原因可能是等離子體在一定程度上促進脂肪的水解，但無法對粳稻內部的不飽和脂肪酸產生氧化作用。

3 結論

采用低溫等離子體技術對根霉、黑曲霉、草酸青霉和亮白曲霉4種稻谷儲藏中常見霉菌進行處理，4種霉菌的抑菌率隨處理時間而顯著上升(P<0.05)。粳稻經過低溫等離子體處理后，除了十五烷酸，其他脂肪酸含量與對照組相比無顯著變化；淀粉含量則有所下降(P<0.05)；實驗組的蛋白質組分中的球蛋白、醇蛋白和清蛋白相比對照組均略有上升，只有谷蛋白的實驗組比對照組顯著下降。適量時間的低溫等離子體處理既能有效地抑制根霉、黑曲霉、草酸青霉和亮白曲霉等4種常見真菌的生長，并且能夠較好地保證稻谷的品質，而長時間的處理則會破壞稻谷的食用品質。本實驗只是初步探究了低溫等離子體技術應用于稻谷霉菌控制領域的可行性。未來對于低溫等離子體的抑菌機理還需更加深入的研究，如該技術對稻谷風味以及感官評價的影響，不同處理電壓、不同氧氣比例對真菌毒素的降解效果等仍需進一步的研究。