降解玉米赤霉烯酮菌株的篩選、降解機制及特性研究

吳宗芮， 丁 軻，， 余祖華，， 李 旺， 李元曉， 曹平華， 何萬領(lǐng)， 賈艷艷， 劉 寧

(河南科技大學(xué)功能微生物與精準(zhǔn)營養(yǎng)實驗室1，洛陽 471003) (洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室2，洛陽 471003)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一種非甾體類真菌毒素，也稱F-2毒素[1]。ZEN主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，廣泛存在于谷類作物及其副屬產(chǎn)品中，如玉米、花生及商業(yè)性飼料等，從而影響飼料的產(chǎn)量和質(zhì)量[2]。這些鐮孢屬物種主要生長在溫帶地區(qū)的植物上，在溫度為20～25 ℃、濕度大于20%的環(huán)境下，ZEN可以在3周內(nèi)產(chǎn)生[3-5]。ZEN化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于雌二醇，可競爭性的與雌激素受體競爭性結(jié)合，引起早情、流產(chǎn)和死胎等，從而影響動物的生產(chǎn)性能[6]。研究表明，低劑量的ZEN可引起細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出致癌性，高劑量的ZEN通過凋亡或壞死誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、DNA損傷、線粒體變性以及引起細(xì)胞最終死亡[7-10]。因此，ZEN嚴(yán)重影響食品安全和畜牧業(yè)，給人類和動物的健康和經(jīng)濟帶來嚴(yán)重的危害。

ZEN去除方法主要分為3種：物理法、化學(xué)法和生物降解法。物理法降解ZEN是通過熱處理和吸附作用，熱處理雖然會達(dá)到高效的降解率，但經(jīng)熱處理后會破壞食品和飼料的營養(yǎng)物質(zhì)。吸附劑處理是利用活性炭、鋁硅酸鹽類等吸附降解ZEN，但各種吸附往往具有特異性，降解效果并不理想。化學(xué)法主要是采用臭氧、雙氧水或碳酸鈉浸泡等處理降解ZEN，但化學(xué)試劑的添加會造成二次污染等弊端。而生物降解法是通過微生物分泌的酶和菌體吸附達(dá)到對ZEN的降解，這種方法耗費成本低，安全性高，并且不會破壞食品或飼料的營養(yǎng)物質(zhì)[11-13]。因此，生物降解法是解決ZEN污染問題的最具前景的措施。已有報道很多微生物對ZEN均有一定的降解效果，但要達(dá)到一定降解效率方可有應(yīng)用價值，所以必須從大量的樣品中進(jìn)行篩選。Risa等[14]從42株紅球菌屬中發(fā)現(xiàn)1株可以降解90%以上的ZEN。Yu等[15]從土壤中分離出1株不動桿菌，用胞外酶在培養(yǎng)基里處理12 h后，未發(fā)現(xiàn)ZEN和雌激素樣的代謝物，Tan等[16]從土壤中分離出2株假單胞菌，在含有2 μg/mL ZEN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，分別能夠降解68%和51%的ZEN。盡管微生物降解ZEN是一種較理想的方法，但所篩選微生物必須是國家允許使用的菌種。本實驗擬以ZEN為唯一碳源，從發(fā)霉飼料、土壤及動物糞便中篩選能夠高效降解ZEN的菌株，為利用該菌株降解不同原料中的ZEN提供了生物材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

1.1.1 樣品采集

河南省洛陽市某養(yǎng)殖廠發(fā)霉飼料、動物糞便、土壤樣品。

1.1.2 主要試劑

ZEN標(biāo)準(zhǔn)品、ZEN常規(guī)ELISA檢測試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(Multiskan-FC)、凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR System) 、PCR 擴增儀(9700T) 。

1.1.4 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：KH2PO41.5 g，Na2HPO42.5 g，(NH4)SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.05 g，pH調(diào)至7.0，蒸餾水1 L，高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min，降至室溫后加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉10 g，pH調(diào)至7.0，蒸餾水1 L，高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min。降至室溫后加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，pH調(diào)至7.0，蒸餾水1 L，高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min。降至室溫后加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將發(fā)霉飼料，動物糞便和土壤分別取約5 g置于200 mL錐形瓶里，加入100 mL的無菌水，于37 ℃、200 r/min振蕩1 h，靜置30 min后，取上清液備用。

1.2.2 ZEN降解菌株的初篩

取200 μL上清液加入含有終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的ZEN的初篩培養(yǎng)基里，于37 ℃、200 r/min振蕩3 d，取上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7倍，分別取100 μL涂布于終濃度為1 μg/mL的ZEN的LB固體培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 ZEN降解菌株的純化

挑取LB固體培養(yǎng)基不同形態(tài)的菌落劃線于終濃度為1 μg/mL的ZEN的LB固體培養(yǎng)基里，反復(fù)劃線純化菌株。

1.2.4 ZEN降解菌株的復(fù)篩

將純化過的菌株接于LB液體培養(yǎng)基里，37 ℃、200 r/min振蕩24 h，取200 μL培養(yǎng)液接種于終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN 5 mL LB液體培養(yǎng)基里，取5 mL LB液體培養(yǎng)基加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN作為空白對照，每個菌株做3個重復(fù)，于37 ℃ 200 r/min振蕩24 h。根據(jù)玉米赤霉烯酮ELISA試劑盒對檢測培養(yǎng)液中的ZEN含量，按照下列公式計算ZEN的降解率，篩選降解率較高的菌株。

ZEN降解率=(Po-Pn)/Po×100%

式中：Po為對照組ZEN的殘留量；Pn為每個菌株發(fā)酵液中ZEN的殘留量。

1.2.5 ZEN降解菌株的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將上述降解效果較好的菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體的顯微形態(tài)。

1.2.5.2 16S rDNA的鑒定

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，以DNA為模板，采用桿菌科細(xì)菌通用引物，上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為：Premix Taq 12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。擴增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，選取較高的同源性序列，運用MEGA6.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 菌株降解機制的驗證

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min振蕩24 h，菌液分成2份，1份放4 ℃冰箱，另1份121 ℃滅菌30 min。將2組菌液離心后分離上清和菌體，菌體用無菌PBS洗滌2次后重懸，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎菌體，獲得細(xì)胞內(nèi)容物。在上述實驗發(fā)揮主要降解作用的部分進(jìn)行處理：加蛋白酶K(65 ℃，水浴2 h)；加蛋白酶K和1% SDS(65 ℃，水浴2 h)；熱處理(100 ℃水浴2 h)。菌體于37 ℃、200 r/min振蕩30 min，其余各處理組振蕩24 h，以終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN的等量PBS作為對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，用玉米赤霉烯酮ELISA試劑盒檢測各處理組中ZEN殘留量。

1.2.7 不同條件對菌株降解ZEN的影響

分別研究ZEN降解菌株的不同時間(12、24、36、48、72 h)、不同溫度(28、35、37、40、42 ℃)、不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)和不同接種量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)對ZEN降解能力的影響，優(yōu)化其發(fā)酵條件。

1.2.8 菌株對不同原料中ZEN的降解

稱取可溶性淀粉、玉米粉和豆粕粉各0.2 g，分別置于50 mL離心管內(nèi)，加入10 mL蒸餾水，將pH調(diào)至優(yōu)化值，121 ℃滅菌30 min，降至室溫后加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的ZEN。將預(yù)先培養(yǎng)好的菌液以優(yōu)化的接種量接入各樣品中，以終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的ZEN的等量各個飼料樣品作為對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)優(yōu)化的時間后取樣，按照ZEN ELISA檢測試劑盒測定各樣品中ZEN的含量。

1.2.9 菌株G-6的安全性實驗

將10只8周齡左右雄性健康的昆明小鼠分為實驗組和對照組2組，每組各5只。將G-6菌株培養(yǎng)過夜后，經(jīng)活菌測定菌株的活菌數(shù)為7.83×108cfu/mL。對照組灌喂無菌生理鹽水，實驗組灌喂G-6菌株，每只小鼠灌胃1.0 mL/d，連續(xù)灌胃為3 d，然后對小鼠為期1周的觀察，每天察看并記錄小鼠的精神狀態(tài)、采食量、飲水量、糞便及死亡情況等。最后對小鼠進(jìn)行處死、解剖，觀察小鼠臟器是否出現(xiàn)病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEN降解菌株篩選結(jié)果

從樣品中分離出96株菌，將初篩分離的菌以ZEN為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，初步分離出14株菌，其中6株來自于發(fā)霉飼料，分別為M-3、L-12、L-6、M-19、G-6、P-17，4株來自于土壤，分別為G-4、P-12、P-21、M-17，4株來自于動物糞便，分別為P-6、M-11、P-25、M-7。

2.2 ZEN降解率的測定結(jié)果

將篩選得到的14株菌接種于含有1 μg/mL ZEN的LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，ELISA檢測ZEN毒素含量。由表1可知，來自發(fā)霉飼料中分離的G-6菌株降解效果最好，降解率達(dá)到81.19%，其余13株分離菌的降解效率均低于51%，因此，選擇G-6菌株進(jìn)行后續(xù)的研究。

表1 分離菌株對ZEN降解率

2.3 G-6菌株的形態(tài)特征

由圖1可見，菌株的菌落形態(tài)為表面粗糙，邊緣不整齊，不透明，中間隆起。菌株的顯微形態(tài)為革蘭氏陽性，桿狀，中等大小，單個存在，少數(shù)呈雙鏈狀。具端生芽孢。

圖1 菌株G-6的菌落特征(a)和鏡檢特征(b)

2.4 G-6菌株16S rDAN PCR擴增及測序結(jié)果

以菌株G-6的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后，產(chǎn)物電泳在約1 450 bp處有一條特異性條帶，與預(yù)期大小相符，見圖2。經(jīng)測序獲知該序列為1 424 bp(GenBank登錄號為SUB10218507)。

圖2 菌株G-6的16S rDNA PCR擴增結(jié)果

2.5 基于G-6菌株16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果

將測序結(jié)果去NCBI進(jìn)行BLAST比對，挑選同源性高于99%的菌株，通過MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可知，G-6菌株與解淀粉芽孢桿菌在同一分支上,親緣性最近。因此，鑒定G-6菌株為解淀粉芽孢桿菌。

圖3 菌株G-6基于16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 G-6菌株降解機制的驗證

菌株的細(xì)胞壁對ZEN有吸附作用。活細(xì)胞的降解率為56.17%，滅活細(xì)胞降解率為38.1%。分析的原因可能是在熱處理的過程中使活細(xì)胞的吸附位點失活，從而減少對ZEN的吸附能力。

由圖4可知，菌株無細(xì)胞上清的降解率明顯高于細(xì)胞內(nèi)容物，說明菌株降解ZEN的能力主要發(fā)生在無細(xì)胞上清，菌株降解ZEN的活性物質(zhì)主要發(fā)生在胞外。對菌株無細(xì)胞上清進(jìn)行不同處理，加蛋白酶K處理后，菌株降解ZEN的效率下降至35.17%；加蛋白酶K和1% SDS共同處理后，菌株降解ZEN的效率下降至13.14%；100 ℃水浴2 h后，菌株的降解效率下降至8.31%。

圖4 菌株不同活性成分對ZEN降解能力

圖5 溫度、pH、接種量、時間對菌株降解效率的影響

2.7 G-6菌株降解ZEN的不同條件的影響

由圖5可知，溫度對菌株降解ZEN有一定影響，在28 ℃降解率最低，降解率為53.74%。隨著溫度的升高，在37 ℃降解率最高，降解率為81.19%。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至42 ℃時，降解率產(chǎn)生了下降，溫度的升高或降低都會對降解率產(chǎn)生影響。可能是在不同溫度的培養(yǎng)下，菌株的生長受到了一定抑制，使菌株活性下降，降解率也隨之下降。

pH對菌株降解ZEN有顯著影響，pH為3.0時，降解率最低，降解率為25.88%。隨著pH的上升，降解率升高，pH為5.0時降解率最高，降解率為88.47%。當(dāng)pH大于5時，降解率下降，pH的升高或降低都會對降解率產(chǎn)生影響。因此在pH為5.0時菌株能發(fā)揮最大的降解率。

接種量對菌株降解ZEN的能力有一定影響，接種量為1%～3%時，隨著接種量的增加，降解率也增加，接種量為3%時降解率最高，降解率為81.98%。當(dāng)接種量繼續(xù)增加時，降解率出現(xiàn)了下降，接種量的升高或降低都會對降解率產(chǎn)生影響。可能是由于接種量太小，不能達(dá)到菌株活性的高度，但太多的接種量會消耗培養(yǎng)基里的營養(yǎng)物質(zhì)，使菌株活性下降。

隨著發(fā)酵時間的延長，菌株的降解率也隨之增加。可能在前期ZEN抑制了菌株生長，使菌株活性低，但隨著發(fā)酵時間的延長，菌株的活性逐漸上升，72 h在LB培養(yǎng)基中達(dá)到100%降解。

2.8 G-6菌株對不同原料中ZEN的降解

將溫度、pH、接種量、時間調(diào)至優(yōu)化值，在發(fā)酵72 h的不同飼料中ZEN含量的采用ELISA檢測試劑盒測定，在72 h后，菌株能在可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉中達(dá)到100%降解。

2.9 G-6菌株的安全性實驗結(jié)果

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組小鼠的精神狀態(tài)、采食量、飲水量、糞便均無異常，且沒有出現(xiàn)死亡和發(fā)病現(xiàn)象。此外，將小鼠處死后觀察發(fā)現(xiàn)小鼠臟器未出現(xiàn)任何異常變化，說明該菌株無毒性和致病性。

3 討論

ZEN是最常見的真菌毒素之一，嚴(yán)重危害人類食品安全和動物飼料安全，篩選切實可行的辦法降解ZEN對保障我國食品和飼料安全具有重要意義。一般在篩選降解菌株需注意：從樣品上應(yīng)選擇發(fā)霉飼料、動物糞便和土壤去篩選，很多高效降解的菌株是在極端的生長條件發(fā)現(xiàn)的[17]，由于菌株在極端條件下長期生存，經(jīng)過大自然馴化，菌株產(chǎn)生了高耐受性，從而形成了有降解活性的微生物；從篩選方法上從培養(yǎng)基內(nèi)加入ZEN或是結(jié)構(gòu)相似的環(huán)戊酮為唯一碳源進(jìn)行篩選，金博文等[18]以環(huán)戊酮為唯一碳源從糞便中篩選到了1株高效降解ZEN的多食鞘氨醇桿菌，為樣品和方法上進(jìn)行定性篩選提供了途徑。本研究以ZEN為唯一碳源，從發(fā)霉飼料中篩選到了1株高效降解ZEN的解淀粉芽孢桿菌，37 ℃24 h內(nèi)從培養(yǎng)基降解了81.19%的ZEN。

解淀粉芽孢桿菌為益生菌，關(guān)于益生菌降解ZEN已有報道。Ragoubi等[19]發(fā)現(xiàn)保加利亞乳酸菌在37 ℃24 h內(nèi)從MRS培養(yǎng)基去除57%的ZEA；Keller等[20]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母可在30 ℃2 d內(nèi)清除培養(yǎng)基里90%的ZEN；耿海榮等[21]篩選出1株枯草芽孢桿菌在50 ℃36 h可降解93%的ZEN。本實驗篩選到的解淀粉芽孢桿菌經(jīng)條件優(yōu)化后降解率均高于這些益生菌，由于菌種之間的差異性以及菌株之間不同的培養(yǎng)條件會影響菌株的生長活性，從而在降解率上表現(xiàn)出了不同差異，當(dāng)菌株在生長環(huán)境適宜，營養(yǎng)條件充分的情況下，菌株生長活性高，才能充分降解ZEN。本研究對菌株在不同飼料原料中的降解進(jìn)行了驗證，調(diào)至各優(yōu)化值在可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉降解了100%的ZEN，均高于Fu等[22]和潘麗婷等[23]篩選到的芽孢桿菌在玉米粉中去除ZEN的降解率，解淀粉芽孢桿菌可作為飼料添加劑去使用，以改善消化，增加營養(yǎng)吸收，優(yōu)化動物的飼料效率，為維護動物機體健康提供了安全保障。

對上清液、細(xì)胞內(nèi)容物、菌體細(xì)胞進(jìn)行降解ZEN的研究，菌株上清液降解率均高于細(xì)胞內(nèi)容物和菌體細(xì)胞，初步認(rèn)為主要降解ZEN的活性物質(zhì)是胞外酶。提取菌株胞外酶降解霉菌毒素已有報道，Qin等[24]從枯草芽孢桿菌克隆了染料脫色過氧化物酶，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，重組的酶基因可降解多種霉菌毒素，王壬豐等[25]將粉紅黏帚霉中的ZEN降解酶ZHD101成功在馬克斯克魯維酵母表達(dá)，并且能降解發(fā)霉玉米樣本中的ZEN。雖然有些微生物能對霉菌毒素產(chǎn)生降解，但由于產(chǎn)生的降解毒性或菌株本身并不是國家認(rèn)定的安全菌株，并不能直接投入到生產(chǎn)中去，然而它們提供的酶基因為預(yù)防霉菌毒素提供了另一種選擇。

4 結(jié)論

本研究以ZEN為唯一碳源進(jìn)行分離篩選，從發(fā)霉飼料里篩選出1株高效降解ZEN的菌株G-6，其降解率為81.19%。通過形態(tài)學(xué)和16S rDAN的鑒定，鑒定G-6為解淀粉芽孢桿菌。菌株主要通過胞外酶發(fā)揮降解作用，同時菌株細(xì)胞壁也有吸附作用。G-6菌株最佳降解ZEN的條件為：溫度37 ℃，pH5.0，接種量3%，培養(yǎng)時間72 h。G-6菌株在終質(zhì)量濃度為1 μg/mLZEN的可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉中達(dá)到100%降解，菌株的安全性實驗證明本菌株無毒。