3株降解玉米赤霉烯酮芽孢桿菌的快速鑒定

劉曉萌， 張云鵬， 仉 磊， 印 鐵， 鄒球龍， 姜德銘， 張曉琳

(北京市畜產品質量安全源頭控制工程技術研究中心，中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是一種由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)、克魯克維爾鐮刀菌(Fusariumcrookwellense)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)等真菌產生的非甾體雌激素類真菌毒素，廣泛污染玉米、小麥、高粱等谷物及其加工副產品[1,2]。ZEN能夠通過污染的農產品及飼料進入食物鏈，引起畜禽動物雌激素綜合癥，影響動物的繁殖性能，引發人體器官病變及癌變[3,4]。ZEN污染不僅造成巨大經濟損失，更嚴重威脅國民健康,因此亟需尋找安全、高效的ZEN降解方法,篩選高效降解ZEN的微生物成為國內外研究熱點。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是一類革蘭氏陽性菌，能夠產生芽孢、抗逆性強、耐貯存，而且發酵后可產生多種酶類及抗菌化合物，被廣泛應用于農業[5]、飼料[6]和發酵工業[7]中。近年來，利用芽孢桿菌進行ZEN降解的研究也逐漸增加[8-11]。但在芽孢桿菌篩選及鑒定過程中，由于芽孢桿菌的不同種群在菌落、菌體形態及生理生化特征上有較多相同之處，難以通過表型特征準確區分；而且素有“細菌化石”之稱的16SrDNA基因高度保守，序列間的相似度太高，無法有效區分芽孢桿菌屬內的近緣物種[12,13]。近年來，研究發現以分子進化速率更大的管家基因作為系統發育鑒定標記可以彌補16SrDNA基因的缺陷，如編碼細菌DNA促旋酶基因：gyrA基因、gyrB基因[14-18]。

本研究對實驗室篩選的3株降解ZEN的芽孢桿菌(Bacillussp. YW、Bacillussp. GJ、Bacillussp. CP)進行鑒定，除開展生理生化鑒定外，還利用16SrDNA、gyrA基因構建的系統發育樹分析，結合貝萊斯芽孢桿菌特異引物對菌株開展進一步鑒定，為ZEN降解菌株的快速篩選及分類鑒定提供一種有效方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室篩選的能夠降解ZEN的3株芽孢桿菌，編號分別為YW、GJ、CP。

1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，水 1 L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min；營養瓊脂(Nutrition Agar，NA)培養基。

1.3 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物，DNA Marker(RTM418-02)、Pfu PCR Master Mix(KP201)、pMD19-T Vector，革蘭氏染色液試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、凝膠DNA小量回收試劑盒(D2111)，ZEN標準品、色譜純乙腈、色譜純甲醇，氨芐抗生素，過濾除菌。

1.4 儀器設備

Mastercycler PCR擴增儀，小型離心機，Eporator電轉化儀，LC-20高效液相色譜儀。

1.5 方法

1.5.1 菌株形態學觀察

取100 μL甘油保菌管中的菌液，涂布于LB平板上進行活化，置于37 ℃培養箱培養過夜，然后用無菌牙簽挑取單菌落在NA平板上進行劃線，置于37 ℃培養箱培養24 h，觀察各個菌株的菌落形態。對37 ℃培養72 h的菌株進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察菌體的形態和大小及芽孢形成位置，拍照記錄。

1.5.2 菌株生理生化特性測定

對菌株的生長溫度、生長pH、氧的需求、耐鹽性、過氧化氫酶、酪素水解等生理生化特性進行了測定。

1.5.3 細菌基因組DNA提取

基因組DNA使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取。

1.5.4 16SrDNA基因、gyrA基因和貝萊斯芽孢桿菌及解淀粉芽孢桿菌特異片段擴增

引物序列：采用通用引物對27F(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3’)對16SrDNA基因進行擴增，采用引物對gyrA-F(5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’)和gyrA-R(5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’)對gyrA基因進行擴增，貝萊斯芽孢桿菌特異性引物為：Bvel-F(5’-CCTTTGCGTTTTGTTACCC-3’)和Bvel-R(5’-CACATCAATTCCTTCTCC-3’)，解淀粉芽孢桿菌特異引物為：Bamy-F(5’-CGTACACCGGCTTCAGAATAC-3’)和Bamy-F(5’-CTTCGCCTCTTGTGGCTTTA-3’)。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，35個循環，72 ℃ 10 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后對目的DNA片段進行膠回收，與T載體連接，篩選陽性克隆子，將驗證正確的質粒進行測序，將測序結果通過NCBI數據庫BLAST在線比對。

1.5.5 系統進化分析

選擇和各個菌株的基因序列相似性較高的菌株序列為參考序列，利用MEGA 5.1軟件進行多序列比對，采用鄰比法構建系統進化樹，自展值為1 000次計算遺傳距離(進化樹展示自展值>50%的數值)。

1.5.6 ZEN降解率的檢測

將培養至穩定期的菌液，6 500 r/min室溫離心5 min，棄上清，將菌體沉淀用50 mol/L Tris-HCl (pH 6.90)緩沖液洗滌2次，然后重懸菌體，將細胞密度調為一致，OD600 nm吸光值為2.0，加入ZEN使其終濃度為10 mg/L，37 ℃，230 r/min振蕩孵育，每隔1 h取樣，加入等體積的甲醇，渦旋混勻30 s，超聲波處理5 min，充分抽提。然后于12 000 r/min條件下離心10 min，取其上清液進行HPLC檢測。

檢測條件：安捷倫Eclipse XDB-C18柱(5.0 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相，乙腈∶水∶甲醇=46∶46∶8；進樣體積，10 μL；流速，1.0 mL/min；檢測波長，激發波長274 nm，發射波長440 nm；ZEN標準曲線方程為y=779 45x-345 90，R2=0.999 9，x為ZEN質量濃度(mg/L),y為峰面積(mv·s)，標準曲線在0.5～20.0 mg/L濃度范圍內線性關系良好。

ZEN降解率=(對照組ZEN含量-實驗組ZEN含量)/對照組ZEN含量×100%。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

3株菌的單細胞形態均呈桿狀、芽孢尖端生長；菌株YW和CP的菌落形態非常相似，菌落呈乳白色、圓形、邊緣不整齊、表面濕潤凸起，菌株GJ菌落呈乳黃色、圓形、邊緣不整齊、表面粗糙不透明。

2.2 菌株生理生化特性

各項生理生化指標的測定參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《微生物學實驗》進行。其生理生化特性見表1所示。

表1 菌株YW、GJ、CP的生理生化特征

2.3 基于16S rDNA基因PCR擴增及系統發育分析

PCR獲得16SrDNA基因大小為1 509 bp，將測序結果利用DNAMAN軟件進行拼接，基因序列導入NCBI數據庫，利用BLAST在線比對，結果顯示YW與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)有最高同源性(99.73%)，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、花域芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)同源性較高(99.60%)；菌株CP與貝萊斯芽孢桿菌有最高同源性(99.73%)，其次與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌有較高同源性(99.50%)；菌株GJ與貝萊斯芽孢桿菌有最高同源性(99.67%)，與枯草芽孢桿菌、花域芽孢桿菌同源性也較高(>99.60%)。從GenBank中選出與目標菌株同源性較高的16株菌株的16SrDNA序列構建系統發育進化樹(圖1)。結果顯示，菌株CP、YW和GJ與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)、解淀粉芽孢桿菌聚為一個小簇，但是分支的自展值較低，無法準確定位3株菌的族群。

圖1 16S rDNA基因序列的系統發育樹

2.4 基于gyrA基因PCR擴增及系統發育分析

PCR獲得gyrA基因大小為1 023 bp，將3株菌的測序結果利用DNAMAN軟件進行拼接，其基因序列分別在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果顯示它們與貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的同源性較高。YW與貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌有最高同源性(99.61%)，菌株CP與解淀粉芽孢桿菌有最高同源性(99.60%)，菌株GJ與解淀粉芽孢桿菌有最高同源性(99.12%)。基于gyrA基因序列采用鄰近法構建的系統發育樹分析顯示(圖2)，貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌分屬于3個分支，其中菌株YW和CP與貝萊斯芽孢桿菌聚為一個分支(Ⅰ)，且自展值較高；菌株GJ與解淀粉芽孢桿菌聚為一個分支(Ⅲ)。

2.5 特異性引物PCR分析

貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌同源性非常高，甚至之前很多貝萊斯芽孢桿菌被分類為解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌[19-21]，但是貝萊斯芽孢桿菌基因組中含有特異的參與D-葡萄糖醛酸鹽代謝的基因，而枯草芽孢桿菌及解淀粉芽孢桿菌中不含此類基因[22]。Dunlap[23]選用D-葡萄糖醛酸鹽代謝途徑中保守的糖激酶基因，設計特異性引物，用于貝萊斯芽孢桿菌的快速鑒定。利用該特異性引物對3株菌(YW、CP、GJ)進行擴增，由圖3a可見，菌株YW和CP在100～200 bp之間出現明顯的特異性條帶，大小約為167 bp，而菌株GJ和枯草芽孢桿菌168(陰性對照)均無條帶，說明菌株YW和CP是貝萊斯芽孢桿菌。此外，根據貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌已公布的gyrA基因序列為靶序列，通過比對，篩選出解淀粉芽孢桿菌gyrA基因獨特的保守區，設計特異性引物，用于解淀粉芽孢桿菌的快速鑒定[24]。由圖3b可見，菌株GJ在100～200 bp之間出現明顯的特異性條帶，大小約為115 bp，而菌株YW、CP和枯草芽孢桿菌168均無條帶，說明菌株GJ是解淀粉芽孢桿菌。

圖2 gyrA基因序列的系統發育樹

注：a為貝萊斯芽孢桿菌特異性引物擴增的結果；b為解淀粉芽孢桿菌特異性引物擴增的結果；YW為芽孢桿菌YW；CP為芽孢桿菌CP；GJ為芽孢桿菌GJ；Bs 168為枯草芽孢桿菌168；M1為1 kb plus DNA分子量標準；M2為100 bp DNA分子量標準。圖3 用特異性引物對3株菌進行PCR鑒定

2.6 降解ZEN能力測定

評估菌株降解ZEN的能力。結果如圖4所示，雖然菌株YW和CP菌落及細胞形態一致，經鑒定均為貝萊斯芽孢桿菌，但是降解ZEN能力不同，因而菌株YW和CP屬于貝萊斯芽孢桿菌的不同菌株。

圖4 菌株YW和CP對10 mg/L ZEN的降解率比較

3 討論

芽孢桿菌種類繁多，包括：地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、花域芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillussonorensis)，以及枯草芽孢桿菌亞種等，近緣物種在形態、生理生化特征及16SrDNA基因序列方面均具有很高的同源性，難以進行準確區分。傳統上，菌株鑒定主要通過DNA雜交同源性分析、脂肪酸組成分析、醌組成分析等方法，但是這些方法不僅操作繁瑣、對設備要求高，而且需要標準菌株作為對照。近年來，研究者發現可以采用相對保守的編碼蛋白的持家基因進行系統發育分析，如Rooney等[25]利用gyrA基因對枯草芽孢桿菌的不同菌株進行多樣性分析，Chun等[15]利用gyrA基因分析了枯草芽孢桿菌與相近種類的進化關系，高艷俠通過構建gyrA基因序列的進化樹有效區分了3個近緣物種[26]，該方法簡單快速、成本低、準確度高，可以廣泛應用。

4 結論

本研究利用16SrDNA結合gyrA基因序列構建系統發育樹，有效區分親緣關系很近的貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；同時借助貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的特異性引物進行PCR分析，實現了3株細菌的快速鑒定。