儲藏時間對大豆蛋白和谷朊粉的結構及功能特性的影響

安紅周， 丁 皓， 黃澤華， 李盤欣

(河南工業大學糧油食品學院1，鄭州 450001) (河南省谷物品質分析與加工國際聯合實驗室2，鄭州 450001) (河南省南街村(集團)有限公司3，許昌 462600 )

大豆分離蛋白(SPI)、大豆濃縮蛋白(SPC)和谷朊粉(WG)作為組織化植物蛋白生產所使用的3種主要原料，應用廣泛。這些蛋白原料從生產到加工成組織化蛋白會有一定的儲藏運輸期，其結構在儲藏過程中可能會由于蛋白氧化而發生一定程度的改變，進而導致其功能特性的變化。有研究表明蛋白質的溶解度、持水性、持油性和巰基含量會顯著影響組織化蛋白的質構特性。

儲藏時間對蛋白質功能特性和分子結構的影響是學者們關注的重點。Boartright等[1,2]研究了SPI在儲藏過程中的蛋白質氧化，發現在儲藏過程中蛋白質的氧化是普遍存在的。劉寶華等[3]研究發現隨著儲藏時間的延長，蛋白氧化導致SPI的表面疏水性降低；劉紫薇等[4]發現經過高溫濕熱處理的SPI變性程度加劇，使更多的疏水基團暴露，導致表面疏水性的提高。Guo等[5]發現不同pH的SPI粉末在37 ℃儲藏過程中羰基含量均顯著增加，溶解度均下降，而巰基含量先降低后變化不顯著；Xu等[6]有同樣的研究結果，且發現不同儲藏期的SPI生產的千頁豆腐品質有顯著性差異。Sun等[7]發現隨著儲藏時間的延長，花生分離蛋白發生變性和聚集，導致游離巰基含量、表面疏水性降低以及二級結構的變化，從而影響其功能特性。由此可見，儲藏期內植物蛋白理化指標(游離巰基含量等)及蛋白結構的變化，對其加工及產品品質具有重要影響。而本研究的3種植物蛋白能夠提供獨特的結構、組織化和營養特性，是組織蛋白生產的重要原料之一，現有文獻鮮有對其表面疏水性、持水性和持油性等特性在儲藏期內的變化有系統研究。因此研究其在儲藏期內的性質變化對蛋白原料的儲藏、組織蛋白的生產以及其加工品質的提升具有重要意義。

本實驗為了縮短儲藏研究周期，利用提高溫度增加反應速率的方法研究原料的性質變化，對3種原料進行加速儲藏實驗[8-10]。根據阿倫尼烏斯公式，對于常規化學反應，在一定溫度范圍內，反應溫度每升高10 ℃反應速度常數提高1倍。一般蛋白粉在常溫干燥的倉庫中儲藏期為12個月，本實驗采用40 ℃(非蛋白開始變性溫度[11-13])加速3個月模擬20 ℃條件下存放12個月。同時采用Ellman試劑法、溴酚藍法、凱氏定氮法分別測定蛋白質的二硫鍵含量、表面疏水性和氮溶指數，研究儲藏期間3種主要組織蛋白原料的結構及功能特性的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白、大豆濃縮蛋白、谷朊粉、2,4-二硝基苯肼、鹽酸胍、DTNB、Tris、三氯乙酸、甘氨酸、EDTA、溴酚藍、考馬斯亮藍G250、β-巰基乙醇，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LXJ-ⅡB低速離心機，CenLee20K臺式高速離心機，UV762紫外可見分光光度計，Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀。

1.3 方法

1.3.1 原料的儲藏

購買最新日期(正式加速儲藏實驗開始前2周內)的大豆分離蛋白(SPI)、大豆濃縮蛋白(SPC)和谷朊粉(WG)。將SPI、SPC和WG采用工廠包裝袋包裝(紙塑復合袋)，置于40 ℃，RH=50%恒溫恒濕箱中儲藏。儲藏時間為90 d，每隔15 d取樣分析。

1.3.2 基礎指標

水分：根據GB 5009.3—2016直接干燥法測定；灰分：根據GB 5009.4—2016測定；粗脂肪：根據GB 5009.6—2016測定；粗蛋白：根據GB 5009.5—2016測定；還原糖：GB 5009.7—2016測定。

1.3.3 分子結構測定

1.3.3.1 羰基含量測定

參考Levine等[14,15]的方法并略加改動：配制一定濃度的溶液，離心后用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質含量。吸取0.35 ml蛋白溶液與1.5 mL含有10 mmol/L的DNPH的2 mol/L的HCl混合，空白樣為蛋白溶液與2 mol/L HCl混合，30 ℃水浴保溫1 h。加入2 mL 20%三氯乙酸后靜置20 min，10 000 g離心10 min 后棄去上清液。用1 mL乙醇-乙酸乙酯混合溶液(1∶1)洗滌沉淀，10 000 g離心10 min棄去上清液，重復洗滌3次。最后用3 mL 0.1 mol/L含6 mol/L鹽酸胍的磷酸鹽緩沖液(pH=7)溶解沉淀，37 ℃水浴30 min，每間隔10 min劇烈振搖1次。以空白為對照在370 nm處作校正，以22 000mol/ (L·cm)為消光系數計算每mg蛋白質羰基衍生物的摩爾數。

1.3.3.2 游離巰基和二硫鍵的測定

利用紫外可見分光光度計，參考薛臘梅[16]的方法進行測定。

1.3.3.3 表面疏水性測定

參考代曉凝等[17]的方法并稍作修改，采用溴酚藍法，取10 mg 蛋白樣品溶于1 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中(pH 7.0)，加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍指示劑混勻10 min后離心(WG：4 000 g，10 min；SPI和SPC：10 000 g，10 min)。將上清液稀釋10倍，空白對照中無蛋白樣品，在595 nm下測其吸光度。結果計算見式(1)。

溴酚藍結合量(μg)=200×(A空-A樣)/A空

(1)

式中：A空為空白的吸光度；A樣為樣品的吸光度。

1.3.4 功能特性測定

氮溶指數測定：根據AACC 46-23測定。

持水性：準確稱取3.00 g儲藏的蛋白樣品于50 mL離心管中,加入20 mL去離子水，充分混勻，室溫下靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，將離心管倒置于濾紙上進一步除去上清液，10 min后稱量質量。持水性大小以每克樣品吸附水的質量表示。

持油性：準確稱取1.00 g儲藏后的WG和3.00 g儲藏后的SPI和SPC樣品與20 mL大豆油充分混勻，3 500 r/min離心20 min，步驟與持水性測定相同。

吸水率：根據GB/T 21924—2008中谷朊粉吸水率測定方法。

1. 4 數據統計方法

每組實驗進行3次平行實驗，利用 SPSS Statistics 25 軟件對數據進行 ANOVA 差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異，采用 Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 原料基本指標

表1為從廠家購進最新日期的原料的基礎指標測定，除水分外，其他均為干基。

表1 原料成分表

2.2 儲存時間對原料羰基含量的影響

蛋白質羰基形成是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，蛋白質羰基含量可直接反映蛋白質的氧化程度[5]。

由圖1可知，隨著儲存時間的延長，3種蛋白的羰基含量整體是上升的，說明蛋白氧化一直在發生。谷朊粉羰基含量起伏可能因為谷朊粉可溶性蛋白粒徑較小，高速離心后沉淀下來的谷朊粉很難離散開，導致洗滌不完全，影響實驗結果。蛋白在儲存中不可避免地接觸到氧氣，活性氧的攻擊會導致蛋白質多肽主鏈骨架斷裂和氨基酸側鏈氧化，也會對蛋白中微量的脂質進攻從而引起脂質過氧化[18]，產生活性羰基物質；同時在儲藏過程中，氨基酸和還原糖之間發生的美拉德反應也會在蛋白質側鏈中引入活性羰基。實驗結果表明蛋白質氧化程度逐漸增加，將會導致肽鏈的斷裂，氨基酸側鏈殘基的氧化以及蛋白質高級結構的改變[19]。

圖1 儲藏過程中蛋白質羰基含量變化

2.3 儲存時間對原料巰基和二硫鍵含量的影響

由圖2、圖3可知，蛋白巰基含量整體呈下降趨勢，SPI和SPC的巰基含量在加速儲存15 d(模擬常溫儲藏2個月)后急劇下降，說明在前15 d(前2個月)時其巰基氧化速率較快，隨著儲存時間的延長，巰基含量緩慢下降；WG在儲存過程中整體呈現緩慢下降的趨勢。巰基含量的下降伴隨著二硫鍵含量的上升，說明巰基被氧化形成二硫鍵。3種蛋白的二硫鍵含量整體趨勢先增大后減小，SPI和WG在加速儲藏45 d(6個月)時，二硫鍵含量達到最大，SPC加速儲存到30 d(4個月)，二硫鍵含量達到最大。隨著儲藏時間的延長，二硫鍵含量下降，這主要是由于蛋白質氧化使巰基被氧化成為不可逆氧化狀態，形成了非二硫鍵的含硫化合物，如亞磺酸和磺酸[6]。郭鳳仙[20]發現在儲藏后期，游離巰基含量上升，推測是由于蛋白氧化導致蛋白結構發生輕微展開，內部巰基暴露出來導致。本實驗過程中蛋白巰基含量同樣有回升現象，表明氧化使蛋白結構伸展。二硫鍵含量在儲藏后期降低可能是由于實驗采用的加速儲存溫度是40 ℃，加快了蛋白氧化的速率，使巰基被氧化的程度加劇，變成不可逆狀態，故本實驗相對完整地研究了蛋白在整個儲藏期(12個月)內二硫鍵含量變化趨勢。SPI的游離巰基含量與低水分組織化蛋白彈性呈顯著正相關[21]，使用最新生產的SPI生產低水分組織蛋白能獲得較好的彈性。

圖2 儲藏過程中蛋白質游離巰基含量變化

圖3 儲藏過程中蛋白質二硫鍵含量變化

2.4 儲存時間對原料表面疏水性的影響

表面疏水性可以用于表征蛋白質的空間構象，衡量蛋白分子表面疏水性基團的相對含量，評價蛋白質的變性程度[22]。溴酚藍與蛋白質上的疏水位點結合，結合的溴酚藍含量越高，即表面疏水性越強[23]。由圖4可知，加速儲藏15 d(2個月)后，溴酚藍含量顯著升高，表面疏水性顯著性增加。隨著加速儲藏時間的延長，表面疏水性有一定程度的下降。在儲藏前期可能是由于蛋白質輕微氧化使蛋白質分子結構伸展，蛋白質內部的疏水性基團暴露，導致表面疏水性增強[24,25]。在儲藏后期，氧化程度增加，暴露的疏水基團由于疏水相互作用聚集起來，生成氧化聚集體，使蛋白質疏水性基團逐漸包埋于分子內部，表面疏水性降低[26]。如黃友如[27]在LOX-亞油酸-大豆蛋白模擬體系中發現隨著大豆蛋白氧化程度的增加，其表面疏水性逐漸下降。

圖4 儲藏過程中蛋白質表面疏水性變化

2.5 儲存時間對原料溶解度的影響

蛋白質的溶解度顯著影響著蛋白質的功能特性，通常用NSI(氮溶指數)來表示蛋白質的溶解度。如圖5所示，SPI的溶解度在加速儲存前60 d(8個月)勻速下降，之后下降變得平緩。SPC的溶解度在加速儲存前30 d(4個月)中下降幅度大，比SPI的下降速率更快，在之后的儲藏中下降速率同樣變得平緩。李祖胤[18]通過添加自由基淬滅劑、單線態氧淬滅劑和還原劑研究發現SPI 溶解度下降可能由二硫鍵的生成并形成不可溶性聚集所導致。本實驗中在加速儲藏前期SPI和SPC的二硫鍵均逐漸增加，且SPC的二硫鍵含量增加速率比SPI的快，這與SPC的溶解度下降趨勢快有一定相關性。當二硫鍵含量下降時，SPI和SPC的溶解度仍然降低，這可能是由于隨著氧化程度的增加，不可溶性聚集體增多，導致溶解度下降[28]。此外，美拉德反應也會影響大豆分離蛋白的溶解性，在長時間反應下，美拉德反應進入高級階段，生成不溶于水的大分子聚合物[29]，使得溶解度降低。

對于WG來說，在整個加速儲藏期內溶解度顯著增加。宋永令等[30]測定不同溫度下谷朊粉的溶解度時，發現溫度在30～60 ℃時，隨著溫度的升高，蛋白質分子結構展開，提高蛋白質分子的分散能力，溶解度逐漸增大。WG的溶解度增加可能是隨著氧化的進行使谷朊粉中的谷蛋白大聚體解聚，蛋白分子結構變得疏松，在水中更易分散，NSI 得以提高[31]。NSI越高，蛋白的組織化能力越好[32]，SPI溶解度降低將會使低水分組織化蛋白感官評價評分降低[21]，SPC的溶解度降低會增加低水分組織蛋白的復水率，降低咀嚼度，同時會減小高水分組織化蛋白的感官評價[33]。

圖5 儲藏過程中蛋白質溶解度變化

2.6 儲存時間對原料持水性、持油性的影響

蛋白質溶解度的變化又進一步影響蛋白質的持水性和持油性等功能特性。如圖6所示，在儲存過程中，3種蛋白的持水性整體上呈現出下降的趨勢，SPC的持水性在加速儲藏前30 d(4個月)下降速率較快，與溶解度變化趨勢相似。在儲藏過程中蛋白中微量油脂的氧化也可能導致持水性的降低。如鄧克權[34]認為大豆蛋白被脂質過氧化產物氧化減小了蛋白質和水結合的能力，導致大豆蛋白的持水性下降。吳偉等[35]利用過氧自由基代替脂質自由基氧化大米蛋白導致其結構改變，更多疏水基團暴露，降低大米蛋白的持水能力。

由圖7可知，SPI和WG的持油性先升高后降低，SPC的持油性在加速儲藏75 d(10個月)后出現顯著性下降，持油性變化趨勢與本實驗測定的表面疏水性變化趨勢相似，可能與蛋白質氧化后親水/疏水性基團分布有關[36]。劉晶等[37]利用丙二醛氧化大豆蛋白，隨著丙二醛濃度的增加，大豆蛋白部分去折疊，疏水性基團外露，持油性呈現先上升后下降趨勢。蔡勇建[38]發現短期儲藏時米糠蛋白氧化程度較低，暴露的疏水基團與脂質相結合而使米糠蛋白的持油性増加；隨著儲藏時間延長，氧化程度加深，大量暴露的疏水基團形成氧化聚集體，減小米糠蛋白對脂質的截留能力，導致持油性顯著下降。

谷朊粉的吸水率是指蛋白質形成面筋的吸水能力，用來衡量其活性[39]。在整個加速儲藏過程中，WG的吸水率在160%左右，沒有顯著性變化，說明WG活性變化不顯著，變性程度較小。

SPI的持油性與低水分組織蛋白的咀嚼性呈顯著正相關[21]，使用加速儲存45 d(6個月)后的SPI生產的低水分組織蛋白的咀嚼性可能會顯著性降低。薛曉程等[40]研究發現谷朊粉的持水性與低水分組織蛋白的黏聚性呈顯著正相關，隨著儲藏的進行，谷朊粉的持水性下降，可能會使組織化蛋白的黏聚性降低。

圖6 儲藏過程中蛋白質持水性變化

圖7 儲藏過程中蛋白質持油性變化

2.7 儲藏過程中各指標間的相關性分析

蛋白質在儲存過程中被氧化，會引起蛋白結構的改變，進而引起功能特性的變化。利用Pearson相關性分析探討蛋白結構和功能特性之間相關性。

如表2～表4所示，各蛋白在儲存過程中蛋白質結構和功能特性之間具有一定的相關性。對SPI而言，羰基含量與巰基含量之間存在顯著負相關，與NSI之間存在極顯著負相關，表面疏水性與巰基含量之間存在極顯著負相關，與持油性之間存在極顯著正相關。對SPC而言，羰基含量與NSI呈極顯著負相關，與持水性呈顯著負相關，巰基含量與表面疏水性之間存在極顯著負相關，與NSI和持水性存在極顯著正相關，NSI與持水性之間呈極顯著正相關。對WG而言，羰基含量與持水性之間存在極顯著負相關，巰基含量與表面疏水性之間存在顯著負相關，NSI與持水性呈顯著負相關。綜合而言，在儲藏初期，蛋白質發生氧化，使巰基被氧化成二硫鍵，同時蛋白質分子結構伸展，埋藏在蛋白內部的疏水性基團暴露，導致表面疏水性和持油性增加，溶解度和持水性下降。隨著儲藏的進行，蛋白質氧化程度加深，巰基被氧化成不可逆的非二硫鍵的含硫化合物，暴露的疏水基團則在疏水相互作用下形成更多的不可溶性聚集體，影響蛋白質親水/疏水基團的分布，導致表面疏水性、溶解度、持水性和持油性的降低。而氧化可能會使WG的谷蛋白大聚體解聚，蛋白質在水中更容易分散，導致其溶解度升高。蛋白氧化顯著影響蛋白分子的結構和功能特性變化，從而影響組織化蛋白的品質。

表2 大豆分離蛋白儲藏過程中各指標的Pearson系數

表3 大豆濃縮蛋白儲藏過程中各指標的Pearson系數

表4 谷朊粉儲藏過程中各指標的Pearson系數

3 結論

通過對原料進行加速儲藏實驗，在儲存過程中，SPI、SPC和WG的功能特性和結構都有顯著性變化。3種蛋白在儲藏過程中均發生了不同程度的氧化，游離巰基含量逐漸減少，二硫鍵含量先增加后減少；同時由于蛋白結構伸展和疏水相互作用，使表面疏水性先增加后降低。SPI和SPC在儲藏過程中NSI降低，WG的NSI逐漸增大。3種蛋白的持水性逐漸降低，而谷朊粉的吸水率。面筋蛋白的活性變化不顯著。SPI和WG的持油性先升高后降低，SPC的持油性在加速儲藏75 d(10個月)出現顯著性下降，與表面疏水性變化趨勢有關。

隨著儲藏的進行，谷朊粉加水后有散筋現象，影響其活性，但吸水率整體卻沒有顯著性變化，谷朊粉結構變化與吸水率的關系有待進一步探究。同時，本實驗室前期研究發現，生產以大豆分離蛋白為主的復配低水分組織蛋白的SPI合適的NSI值在66.11%～82.57%之間，SPC合適的NSI值在39.82%～50.10%之間，因此在加工生產組織化蛋白時，儲藏的SPI建議不超過6個月，而SPC建議不超過4個月。為了防止谷朊粉散筋現象對組織化蛋白品質造成影響，WG建議現產現用。